芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株DNA片段的克隆

摘要

该论文的主要内容是关于芹菜夜蛾核型多角体病毒(Syngrapha Falcifera Multip1e Nuclear Polyhedrosis Virus,SfaMNPV)D克隆株基因组的限制性内切酶图谱分析和按鸟枪法(shotgun approach)用质粒pUC18作载体,对EcoRI完全酶切片段进行的分子克隆,并且随机的抽取克隆片段H进行了序列测定和分析.酚-氯仿-异戊醇法体取SfaMNPV-D克隆株基因组DNA,用EcoRI、HindⅢ、PstI、BamHI4种限制性内切酶酶解消化,以Lambda噬菌体DNA经EcoRI/HindⅢ酶解所得各片段作为分子量标准,以片段的迁移距离为横坐标,以各个片段的大小(Kb)的常用对数值为纵坐标作标准曲线,根据酶切片段的迁移距离从标准曲线上求出各个片段的大小,由此计算出病毒基因组相对分子量为113.12Kb.病毒基因组经限制性内切酶EcoRI酶解,酶解片段不经过凝胶电泳分部分离,直接与pUC18载体在体外进行连接,pUC18载体经CIP处理,连接后的产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞,以氨卞抗性和α-互补为筛选标记挑取重组菌落,提取质粒DNA后,酶切分析鉴定克隆片段,证明获得了10个插入了病毒DNA片段的重组质粒.随机的抽取重组病毒DNA片段H序列测定,序列分析结果显示:H片段含有基因vp1054和lef-10的部分同源序列,但基因不完整,目前测序和序列工作仍在进行.

目录

文摘

英文文摘

缩略语

研究背景资料

一杆状病毒简介

二杆状病毒研究意义

三结束语

实验材料

1病毒和昆虫

2菌株

3载体

4限制性内切酶及其他酶类

5常用试剂

6培养基

7缓冲液

8其它溶液

9分子量标准

实验方法

一SfaMNPV-D克隆株病毒的活体扩增及纯化（李敏棠等，1986；尚汉美等，1981）

二病毒基因组NPV的提取（李敏棠等，1986；严家琪等，1982）

三病毒基因组DNA的限制性内切酶分析（Vlak J M,et al,1981;J萨姆不鲁克等，1993）

(一)酶切反应

(二)琼脂糖凝胶电泳

四酶切片段的分子克隆（Cochran M A,et al,1982;吴乃虎，1989；Maeda S,et,al,1990）

(一)病毒DNA酶切片段的纯化

(二)载体DNA的处理

(三)重组质粒的构建

(四)感受态细胞的制备(CaCl2法)

(五)重组质粒的转化

五阳性克隆的筛选与鉴定(J萨姆不鲁克等，1993；Vlak J M,et al,1981)

(一)筛选

(二)重组质粒的提取(碱裂解法)

(三)鉴定

六SfaMNPV-D克隆株DNA EcoR Ⅰ片段基因序列测定与分析

结果与分析

一SfaMNPV-D DNA的限制性内切酶酶解图谱

二重组质粒中SfaMNPV-D DNA片段的鉴定

三序列分析结果

四存放时间不同总DNA酶切结果

讨论

参考文献

在读期间论文发表情况

致谢