使用荧光纳米材料实时跟踪技术可视化研究病毒与细胞相互作用

摘要

病毒与宿主细胞蛋白的相互作用一直以来是病毒学界的研究热点。例如在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的研究中，科研工作者通过建立HCV的细胞模型(亚基因组复制子模型和全长基因组复制子模型)来研究细胞与病毒的相互作用，研究发现了两个十分重要的抗病毒药物设计靶点即NS3丝氨酸蛋白酶以及NS5BRNA依赖性RNA聚合酶。
　　 但所有类似的研究都需要基于一定的方法和策略。在SV40与Vero细胞的研究中使用诸如MβCD、nocodazole等药物并结合细胞器染色技术来研究病毒与细胞相互作用机理。而近年来使用化学发光试剂标记病毒衣壳蛋白或假病毒粒子(virus-like particles，VLPs)以研究病毒与细胞相互作用则是很有应用前景的新方法。
　　 本研究基于我们实验室研究平台并结合化学领域中新合成的发光纳米材料(例如量子点，“光开关”等)的优势，研究两种无囊膜的病毒即兔出血热病毒(rabbithemorrhagic disease virus,RHDV)和人类博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)主要衣壳蛋白在昆虫细胞中形成的VLPs与Sf9(Spodoptera frugiperda)、RK13(rabbit kidney13)以及猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)与猪精细胞(porcine testis，PT)的相互作用，进而揭示病毒在细胞中的运动途径，阐明病毒与宿主细胞的相互作用机制，并根据这些数据来探索建立一个病毒与细胞相互作用的一般研究方法。其完成的工作包括以下几个方面：
　　 1.表达并纯化出兔出血热病毒RHDV衣壳蛋白VP60;
　　 1)将RHDV衣壳蛋白基因VP60插入到pMAL-c2X载体，获得重组质粒pMAL-VP60并在大肠杆菌DH5α中表达VP60蛋白，经SDS-PAGE及Western Blot检测后，扩大培养并利用Amylose亲和层析柱纯化VP60蛋白。并将纯化出的VP60蛋白尝试在体外控制条件下使其自组装成VLPs。
　　 2)使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在High-Five cell(Hi-5)昆虫细胞中表达VP60蛋白。重组Bacmid感染Sf9并使用MOI为5～10的病毒再感染Hi-5细胞以表达VP60-VLPs，然后使用蔗糖及CsCl梯度离心获得较纯净的VLPs，电镜观察。
　　 2.表达并纯化HBoV衣壳蛋白VP2;
　　 1)将HBoV衣壳蛋白基因VP2插入到PET-28(a)载体，获得重组质粒PET-28(a)-VP2并在大肠杆菌BL21中表达VP2蛋白，操作方法同上。纯化获得的VP2蛋白主要用于制备多克隆抗体。
　　 2)使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Hi-5真核细胞中表达HBoV假病毒衣壳VP2-VLPs蛋白，纯化方案同上并电镜观察。
　　 3.量子点(Quantum Dots,QDs)标记VP60-VLPs后与Sf9及RK13相互作用研究方法的初步探索。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1 RHDV、HBoV的介绍

1.1.1 RHDV病毒特征、基因组结构

1.1.2 HBoV病毒基因组结构及特征

1.2 RHDV、HBoV与细胞蛋白的作用研究

1.2.1病毒与细胞的相互作用

1.2.2 RHDV及VLPs与细胞作用研究

1.2.3 HBoV与细胞作用研究

1.3 pMALTM原核表达系统

1.3.1 pMALTM原核表达系统简介

1.3.2质粒pMAL-c2X(AmpR)相关信息

1.4 Bac-to-Bac(R)杆状病毒表达系统

1.4.1 Bac-to-Bac(R)杆状病毒表达系统简介

1.4.2杆状病毒表达系统表达目的蛋白步骤

1.5量子点(Quantum Dots,QDs)及其标记技术介绍

1.5.1量子点(QDs)

1.5.2 QDs的标记技术

1.6本文研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1实验仪器和设备

2.2实验材料

2.2.1菌株、质粒

2.2.2试验中所用到的细胞和病毒

2.2.3药品和相关试剂耗材

2.2.4细菌培养基及配制方法

2.2.5细胞培养基及配制方法

2.2.6缓冲液及配方

2.2.7蛋白纯化时所用的试剂及配制方法

2.3实验方法

2.3.1碱解法提取质粒DNA

2.3.2 DNA片段的回收与纯化：按胶回收试剂盒操作进行

2.3.3 PCR扩增VP60基因

2.3.4构建携带VP60基因的重组载体(构建携带VP2基因的重组载体参考此操作)

2.3.5阳性克隆的筛选和鉴定

2.3.6 VP60蛋白的诱导表达及产物的SDS-PAGE、Western-Blotting检测

2.3.7分离纯化带有MBP标签的VP60蛋白

2.3.8细胞培养

2.3.9VLPs蛋白真核细胞表达与纯化以及标记方法

2.3.10 VP2-VLPs蛋白真核细胞表达及纯化策略(参见2.3.9.2步骤)

第三章 实验结果及其分析

3.1 VP60基因的克隆与重组质粒的鉴定

3.1.1 VP60序列的扩增

3.1.2重组质粒pMAL-VP60的构建和阳性克隆的筛选鉴定

3.2 MBP-VP60融合蛋白的诱导表达及条件优化

3.2.1融合蛋白的诱导表达

3.2.2表达条件的优化

3.3表达产物的纯化及结果分析

3.4纯化后的VP60蛋白在体外条件下的自组装条件探索

3.5 RHDV-VP60蛋白在真核细胞中表达、纯化及标记后与细胞的相互作用

3.5.1 VP60蛋白在真核细胞中表达及纯化

3.5.2 VP60标记后与细胞作用

3.5.3试验结果分析

3.6 HBoV-VP2蛋白在原核及真核细胞中表达及纯化

3.6.1 VP2蛋白在原核细胞中表达

3.6.2 VP2蛋白真核细胞表达及纯化

3.6.3分析

第四章总结和展望

4.1总结

4.2展望

参考文献

致谢