棉铃虫甾醇载体蛋白2(SCP-2)基因的鉴定和功能研究

摘要

甾醇载体蛋白-2(SCP-2)是广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物细胞内的一种非特异性脂质转运蛋白，它与细胞内的胆固醇和脂质的转运密切相关。目前世界上关于甾醇载体蛋白-2(SCP-2)方面的研究主要集中在脊椎动物体，昆虫SCP-2方面的研究比较欠缺。SCP-2是参与昆虫体内胆固醇运输的主要载体蛋白。本文以广泛存在于世界各地的鳞翅目农业害虫棉铃虫为实验对象，用RT-PCR的方法检测了包括卵在内不同龄期(3-5龄)棉铃虫幼虫体内不同组织(幼虫头部(Head)，脂肪体(FB)，中肠(Mdg)，后肠(Hdg)，马氏管(Mt)以及背部表皮(Ep)组织)内SCP-2的转录，发现SCP-2在幼虫不同龄期不同组织内均有表达，在喂食期，特别是四龄五龄幼虫的中肠和脂肪体内含量较为丰富，在低龄幼虫体内的部位组织，例如头部，后肠，背部表皮，马氏管内的含量较少。在蛹期以及成虫期的各组织内表达量较低。通过Western blot技术在棉铃虫四龄五龄幼虫不同组织(幼虫头部(Head)，脂肪体(FB)，中肠(Mdg)，后肠(Hdg)，马氏管(Mt)以及背部表皮(Ep)组织)内检测到大小为17KD的可与抗AeSCP-2的多克隆抗体特异性结合的SCP-2蛋白，由此确定棉铃虫体内不同组织内均有SCP-2蛋白。本研究分离提取四龄幼虫中肠和脂肪体总的RNA，通过RT-PCR的方法，分离鉴定了四龄幼虫中肠和脂肪体内的SCP-2基因，得到长度为442bp的序列，并且用RACE技术扩增出SCP-2 cDNA的3'末端，得到649bp长度的序列。用对埃及伊蚊具有抑制作用的抑制剂AeSCPI-1和AeSCPI-2，进行浓度梯度稀释后(10mM，1mM，0.1mM，0.01mM)，对其进行活体生物测定，发现当抑制剂浓度较低时(0.01mM)，对棉铃虫幼虫的影响不大，抑制剂浓度为1mM时，对棉铃虫低龄幼虫，尤其是一龄幼虫的生长发育有一定的影响，主要表现为体重减轻。
　　 本实验结果对棉铃虫体内SCP-2完整cDNA序列的获得，SCP-2在活体与细胞内的定位，阐明SCP-2对胆固醇的转运机制，以及HaSCP-2抑制剂的研制与筛选奠定了理论基础。将HaSCP-2作为一种新型的生物靶标，对寻找开发新型环保的生物杀虫剂具有十分重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1胆固醇

1.1.1昆虫体内胆固醇的作用

1.1.2胆固醇的合成途径

1.1.3胆固醇在生物体内的运输形式

1.2 SCP-2

1.2.1 SCP-2家族成员

1.2.2埃及伊蚊甾醇载体蛋白-2(AeSCP-2)

1.3 AeSCPI

1.4本研究的目的和意义

2.实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1棉铃虫的饲养

2.1.2菌种与质粒

2.1.3主要试剂和试剂盒

2.1.4试剂的配置

2.1.5主要仪器设备

2.2实验操作以及方法

2.2.1棉铃虫幼虫活体生物测定

2.2.2棉铃虫幼虫不同龄期不同组织的收集

2.2.3 Trizol法提取组织总RNA和蛋白质

2.2.4 RT-PCR法对目的基因SCP-2的扩增

2.2.5 RACE法对棉铃虫幼虫SCP-2基因cDNA扩增

2.2.6 SCP-2的Western Blot检测

3.实验结果

3.1棉铃虫幼虫组织总RNA电泳检测

3.2棉铃虫四龄幼虫中肠(Midgut)和脂肪体(Fatbody)的HaSCP-2基因片段的PCR扩增以及序列测定

3.3不同龄期不同组织的棉铃虫幼虫的SCP-2基因RT-PCR检测

3.4棉铃虫幼虫中肠／脂肪体HaSCP-2 cDNA3'末端的扩增

3.5棉铃虫SCP-2 cDNA部分序列的扩增

3.6不同龄期不同组织的棉铃虫幼虫的SCP-2 SDS-PAGE检测结果

3.7不同龄期不同组织的棉铃虫幼虫的SCP-2 Western Blot检测结果

3.8棉铃虫幼虫活体生物测定

4.讨论

参考文献

在校期间发表的论文以及科研成果

致 谢