人细小病毒B19结构蛋白VP1独特区多克隆抗体的制备及其磷脂酶A2活性的研究

摘要

人类细小病毒B19于1975年由Cossart首次发现于英国献血人员血清中。它是目前仅有的两种可以感染人的细小病毒之一，在全世界广泛分布。B19病毒基因组全长约5.6kb，编码一个非结构蛋白NS1，以及两个组成病毒衣壳的结构蛋白：VP1(84kDa)和VP2(58kDa)，两种结构蛋白基因是典型的重叠基因，VP1的N-末端有一个由227个氨基酸组成的VP1独特区。最近对大约34种不同细小病毒的研究发现，其VP1蛋白的N-末端独特区有一个保守的结构模型(HDXXY及YXGXG)，已有研究证明细小病毒的VP1独特区具有磷脂酶A2活性，该活性对于病毒的复制感染是必须的，因此该区域已成为抗体药物设计的一个潜在靶标。目前国内对该方面的研究较少，对细小病毒B19独特区的研究具有重要意义。
　　 本实验通过定点突变技术对B19结构蛋白VP1独特区的关键氨基酸进行突变，检测突变后该区域磷脂酶A2活性的变化，从而更加深入的研究该病毒独特区的功能。首先，根据B19病毒VP1独特区序列设计引物，扩增得到该基因连接到表达载体pMAL-c2x中，得到重组质粒pMal-VP1u。测序正确后应用pMALTM原核表达系统，在大肠杆菌中成功诱导表达带有MBP-tag的重组融合蛋白，Amylose亲和层析柱纯化融合蛋白，利用pMal-c2x载体在多克隆位点处含有的Factor Xa酶切位点，将融合蛋白中标签蛋白MBP切除后，免疫新西兰大白兔制备得到VP1u多克隆抗体。
　　 其次，以本实验室已构建完成的重组质粒PUC-VP1u作为模板，利用定点突变技术，PCR扩增得到突变体克隆，测序正确后，再将含有突变位点的独特区片段构建到表达载体pMal-c2x中，获得重组克隆pMal-mVP1u。运用此方法，分别得到133，175，195位关键氨基酸突变的pMal-mVP1u。同样的，应用pMALTM原核表达系统纯化得到融合蛋白，测定蛋白浓度后经Factor Xa酶切除标签蛋白，体外测得磷脂酶A2活性。结果显示，同细小病毒科其他病毒一样，B19 VP1u具有磷脂酶A2活性，经抗体孵育处理后，该酶活性受到明显抑制。133，175位关键氨基酸突变后VP1u基本失去磷脂酶A2活性，而195位关键氨基酸突变的B19VP1u仍具有磷脂酶A2活性。本实验结果为继续深入研究和阐明磷脂酶A2在病毒复制感染过程中的作用机制及该病毒感染的发病机理奠定了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.引言

1.1细小病毒科简介

1.1.1细小病毒科的特征和分类

1.1.2细小病毒基因组结构特征

1.2人细小病毒B19介绍

1.2.1细小病毒B19的发现

1.2.2细小病毒B19分子生物学特征

1.2.3细小病毒B19感染与疾病

1.3细小病毒VP1独特区的磷脂酶A2活性研究

1.3.1磷脂酶A2简介

1.3.2细小病毒VP1独特区磷脂酶A2活性的研究

1.3.3 B19病毒、VP1独特区与磷脂酶A2的活性的研究

1.4 PCR介导的定点突变

1.5 pMALTM原核表达系统

1.5.1 pMALTM原核表达系统简介

1.5.2质粒pMAL-c2x(AmpR)的相关信息及克隆策略

1.5.3应用pMALTM原核表达系统进行本实验的具体方案(如图6)

1.6磷脂酶A2活性的测定原理

1.7研究的目的和意义

2.实验材料和方法

2.1主要实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2药品和试剂

2.1.3常用溶液及配制(见表1)

2.2实验方法

2.2.1氯化锂法提取质粒DNA

2.2.2 PCR的扩增

2.2.3限制性内切酶Dpn Ⅰ筛选突变PCR产物

2.2.4 DNA片段的回收与纯化

2.2.5原核表达载体的构建

2.2.6融合蛋白的诱导表达分析

2.2.7诱导表达条件的优化

2.2.8 MBP-VP1u(未突变和突变)融合蛋白的分离纯化

2.2.9 MBP-VP1u多克隆抗体的制备

2.2.10多克隆抗体Western Blotting检测免疫学活性

2.2.11磷脂酶A2活性测定

3实验结果

3.1 vp1u序列的克隆与重组质粒的鉴定

3.1.1重组质粒pMAL-VP1u的构建和酶切鉴定

3.1.2重组质粒pMAL-mVP1u的构建和酶切鉴定

3.1.3目的片段测序结果

3.2MBP-VP1u(未突变和突变)融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化

3.2.1融合蛋白MBP-VP1u的诱导表达

3.2.2融合蛋白MBP-mVP1u的诱导表达

3.2.3融合蛋白MBP-VP1u表达条件的优化

3.3 MBP-VP1u(未突变和突变)融合蛋白的纯化及酶切

3.3.1 MBP-VP1u融合蛋白的纯化

3.3.2 Factor Xa酶切融合蛋白MBP-VP1u

3.3.3 MBP-mVP1u融合蛋白的纯化

3.3.4融合蛋白溶度测定

3.4 MBP-VP1u特异性抗体的Western-Blotting检测

3.5磷脂酶A2活性的测定

3.5.1 B19 VP1u磷脂酶A2活性的测定

3.5.2关键氨基酸突变B19 VP1u磷脂酶A2活性的测定

4.讨论和展望

4.1讨论

4.1.1应用pMALTM原核表达系统制备B19 VP1独特区多克隆抗体

4.1.2 B19 VP1独特区磷脂酶A2活性的测定

4.2展望

参考文献

附录：本文缩写词

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢