小菜蛾颗粒体病毒抗凋亡基因iap的功能研究

摘要

小菜蛾是发生在十字花科蔬菜上最具破坏性的世界性害虫之一，发生代数多，极易对化学农药产生抗性。小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostella granulovirus，PlxyGV)是小菜蛾的天然控制因子。其基因组全序列已于2000年发表。 IAPs(inhibitor of apoptosis)是一类抑制细胞凋亡蛋白家族的总称。它们在结构上都含有BIR、RING结构域。杆状病毒感染常会引起宿主细胞的免疫反应，使细胞凋亡。抑制细胞凋亡可以延长细胞的存活时间，从而可以维持病毒的复制增殖和传播。根据PlxyGV基因组序列分析，PlxyGV中含有一个iap同源基因(nt80675-81520)。序列比对分析显示，PlxyGV iap基因预期编码产物与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)IAPs以及苹果小卷叶蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus，CpGV)IAP3序列相似度较高。功能互补性试验已证实CpGV IAP3具有抗细胞凋亡的功能，而PlxyGV IAP的功能未知。 本研究采用瞬时表达的方法研究PlxyGV IAP的功能。首先，用PlxyGV iap瞬时表达质粒转染草地贪夜蛾细胞系（Spodoptera frugiperda，Sf9）;再在培养液中加入放线菌酮D或接种AcMNPV p35缺失突变体(AcMNPV△P35)感染液;通过光镜观察，流式细胞仪检测和DNA梯度电泳图谱等方法检测细胞的凋亡情况。实验结果显示，在接种AcMNPV△P35的情况下，被PlxyGV iap转染的Sf9细胞的凋亡率显著低于未被PlxyGV iap转染的细胞;在用放线菌酮D处理的情况下，被PlxyGV iap转染的Sf9细胞的凋亡率与未被PlxyGV iap转染的细胞相比无显著差异。由此推断，在Sf9细胞中PlxyGV IAP可以有效地抑制由AcMNPV△P35诱导的细胞凋亡;而不能有效抑制放线菌酮D诱导的细胞凋亡。 为了进一步确定PlxyGV IAP抑制细胞凋亡作用的功能域，用PCR方法对PlxyGV iap基因做渐进截短突变，将截短突变体用于对AcMNPV△P35诱导的细胞凋亡抑制实验。实验结果显示，PlxyGV IAP的BIR结构域或RING结构域的破坏，都会导致IAP抗细胞凋亡功能的丧失。

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