原卟啉原氧化酶催化机理及其抑制动力学的研究

摘要

原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase,Protox／PPO,EC1.3.3.4)是叶绿素和亚铁血红素相同生物合成步骤中的最后一个酶,其广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。在原卟啉原氧化酶的催化作用下,无色的原卟啉原Ⅸ被氧化,失掉六个电子生成共轭的光敏性物质原卟啉Ⅸ。
　　 研究表明原卟啉原氧化酶定位在叶绿体和线粒体中,对于叶绿素和亚铁血红素的合成具有重要的作用,这就决定了它在生命体系中具有重要的意义。在人体中,该酶的缺损会造成显性遗传疾病——混合型卟啉症(Variegated Porphyria,VP)的产生,这种病又称杂色卟啉病,为一种常染色体显性遗传疾病。这种疾病患者的数量和发病地域正在不断扩大,因此对该酶的研究具有重要的医学意义。在植物体内,原卟啉原氧化酶是光依赖性除草剂的作用靶标,除草剂与底物竞争性抑制的结果会导致绿色植物组织的干枯与白化,从而死亡。这在研发新型的抑制剂上引起了农药学家的关注,因而对该酶的研究具有重要的农学意义,我们希望从酶水平利用分子生物学手段,研究抑制剂与酶的作用机制,从而指导新型抑制剂的合成与研发。
　　 基于原卟啉原氧化酶在医学和农学中的重要性,我们主要进行了以下四方面的工作:
　　 一、通过对多种蛋白晶体培养条件的摸索优化,对人体PPO晶体进行培养,得到了分辨率为1.9(A)的人体PPO与其抑制剂三氟羧草醚(AF)的复合物晶体结构,为理解人体混合型卟啉症的发病机制和PPO催化机理的研究提供了重要的结构信息。
　　 二、在结构和模拟计算支持的前提下,识别了在人体PPO活性空腔中对催化过程有重要作用的氨基酸残基,采用DonⅠ突变方法建立了基因突变体系,并对其活性进行测定,验证了这些氨基酸残基的重要性。
　　 三、对原卟啉原氧化酶的氧化机理进行了进一步的研究,并且采用stopped-flow的方法测得了O2加速酶反应的速率常数,提出了PPO新的催化氧化机制。
　　 四、通过高通量筛选对PPO类抑制剂的抑制动力学进行了研究,寻找出了活性更高的化合物,在这些化合物结构的基础上,通过计算机模拟对不同官能团的影响进行总结,对高效新型抑制剂的研发具有指导意义。
　　 综上所述,本文从结构生物学的角度对人体原卟啉原氧化酶进行研究,所得到的实验结果对抑制剂的分子设计和VP卟啉症的研究具有指导作用。在此基础上结合计算化学对原卟啉原氧化酶与底物、抑制剂、辅助因子之间的相互作用进行了研究。本文通过对抑制剂合理的分子设计和高通量筛选,为设计高效专一、开发新型抑制剂提供重要的理论指导和新思路。

目录

文摘

英文文摘

第一章 研究背景介绍

1.1 原卟啉原氧化酶概述

1.1.1 原卟啉原氧化酶的作用及其在细胞中的定位

1.1.2 原卟啉原氧化酶的亚基组成

1.1.3 原卟啉原氧化酶的辅酶

1.1.4 原卟啉原氧化酶的底物

1.2 原卟啉原氧化酶的活性测定

1.2.1 原卟啉原氧化酶催化的反应

1.2.2 原卟啉原氧化酶的活性测定原理

1.2.3 底物原卟啉原Ⅸ的制备

1.2.4 底物原卟啉原Ⅸ的定量

1.2.5 原卟啉原氧化酶反应动力学

1.2.6 原卟啉原氧化酶抑制动力学

1.3 原卟啉原氧化酶的反应机理研究

1.4 原卟啉原氧化酶的晶体结构研究

1.4.1 烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构

1.4.2 粘球菌Myxococcus xanthus原卟啉原氧化酶的晶体结构

1.4.3 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis原卟啉原氧化酶的晶体结构

1.4.4 微小细菌Exiguobacterium sp.255-15原卟啉原氧化酶的晶体结构

1.4.5 人体原卟啉原氧化酶的晶体结构

1.4.6 种属间原卟啉原氧化酶晶体结构的比较

1.5 原卟啉原氧化酶的医学和农学研究

1.5.1 原卟啉原氧化酶的医学研究

1.5.2 原卟啉原氧化酶的农学研究

1.6 本文的研究目的和主要内容

第二章 人体原卟啉原氧化酶及其突变体的研究体系

2.1 人体原卟啉原氧化酶介绍

2.1.1 人体原卟啉原氧化酶的基本性质

2.1.2 人体原卟啉原氧化酶的研究价值

2.2 人体原卟啉原氧化酶的表达和纯化

2.2.1 实验仪器与材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果与小结

2.3 人体原卟啉原氧化酶的活性测定研究

2.3.1 实验仪器与试剂

2.3.2 实验方法

2.3.3 实验结果与小结

2.4 人体原卟啉原氧化酶晶体培养

2.4.1 实验仪器和材料

2.4.2 实验方法

2.4.3 实验结果和小结

2.5 人体原卟啉原氧化酶及其突变酶的相关性质研究

2.5.1 突变体系的建立

2.5.2 实验结果与小结

第三章 原卟啉原氧化酶氧化机理的研究

3.1 研究对象的选择

3.2 O2在PPO催化反应中的作用

3.2.1 原卟啉原氧化酶催化机理的新认识

3.2.2 利用荧光实时监测酶反应

3.2.3 利用stopped-flow测定酶反应的速率常数

第四章 原卟啉原氧化酶抑制动力学的研究

4.1 原卟啉原氧化酶抑制剂简介

4.2 原卟啉原氧化酶商品化除草剂抑制动力学研究

4.2.1 实验目的

4.2.2 实验方法

4.2.3 实验结果与讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录

附录 A人体原卟啉原氧化酶突变体测序结果比对图

附录 B氨基酸的结构和中英文名称及简写符号

附录 C氨基酸密码子表

附录 D FAD与三氟羧草醚的结构

个人简历

在学期间发表的学术论文和研究成果

致谢