中华卵索线虫cDNA文库构建及Sox-3基因部分片段的克隆

摘要

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)属于线虫纲Nematouda毛管超目Trichosyfingida索目Mermithida索科Mermithidae六索线虫亚科Hexamermithinae卵索线虫属Ovomermis，是一种昆虫病原线虫。该线虫营寄生生活，寄主广泛，寄生率几乎等于害虫的死亡率，具有很大生物防治潜力。现阶段人们常采用喷洒化学农药的方法来防治农业害虫，但同时也间接地杀害了田间的中华卵索线虫，导致其数量锐减并面临灭绝的危险，且目前实现其大量体外培养的条件尚未成熟。本研究的目的在于通过构建中华卵索线虫cDNA文库来保存该物种基因资源，便于相关功能基因的筛选和研究。cDNA文库是以特定组织或细胞的mRNA为模板，通过逆转录酶逆转录形成cDNA，经载体连接且转化受体菌后形成重组DNA克隆群。所构成的文库包含该组织或细胞的全部mRNA信息，反映其特定阶段基因的表达情况。cDNA文库较基因组文库小，便于特异基因的筛选，自1976年首次成功构建cDNA文库以来，相继出现标准化cDNA、染色体区域特异性cDNA文库、消减cDNA文库、酵母双杂交cDNA文库、SMART cDNA文库等构建方法。随着科学技术的发展，文库构建的方法越来越简便，文库的质量也越来越高。
　　 本实验使用Trizol试剂从各发育期中华卵索线虫提取总RNA，以其作为反转录模板，通过Clontech公司购买的CreatorTM SMARTTM试剂盒构建cDNA文库，与T载体连接后电转大肠杆菌，涂布在含相应抗生素的LB固体平板37℃过夜培养，第二天收集菌落，且滴度测定，实验数据表明所构建的cDNA文库滴度为1.16×109cfu/ml，包含克隆数为6.0×106，重组率接近100％。符合cDNA文库构建标准，可用于后续基因的筛选和功能研究。
　　 Sox基因家族保守性较高，普遍表达于鸟类、鱼类、爬行类等动物中，通过对其功能研究发现，该基因在性别决定与分化、神经系统的发育、早期胚胎的发育、软骨和组织器官的形成中起重要作用。Sox基因在脊椎动物中研究的较多，而无脊椎动物中，只在秀丽线虫和果蝇中报道过。本实验旨在以中华卵索线虫为实验材料来探究该物种中是否同样存在Sox-3基因，实验结果通过同源性序列比对分析，表明已克隆得到Sox-3基因的保守片段。