苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ODV--E25与几种宿主蛋白相互作用的研究

摘要

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）ODV-E25是芽殖型病毒体与包涵体源性病毒体共有的囊膜蛋白。本实验室在前期工作中通过酵母双杂交从Sf9细胞cDNA文库中筛选出了四种与AcMNPV ODV-E25(E25)相互作用的宿主细胞蛋白基因。这四种宿主蛋白基因分别编码核糖体蛋白RPL41、Arp2/3复合体的P21亚基、乙醇脱氢酶和eIF3G的同源蛋白。本研究用不同的实验方法验证了E25与RPL41及P21间的相互作用。本研究的主要内容如下: （一）AcMNPV E25与P21双荧光亚细胞共定位分析: 将odv-e25(e25)和p21分别与egfp及rfp融合，通过Bac-to-Bac重组技术构建同时表达E25-EGFP和P21-RFP两种融合蛋白的重组病毒并感染Sf9细胞。感染后不同时间点共聚焦显微镜下检测结果显示红色荧光与绿色荧光的分布区域重叠，表明E25与P21存在共定位现象。 （二）AcMNPV E25与RPL41(或P21)双分子荧光互补分析: 将e25与YFP的C-端编码序列(c155)融合，将rpl41和p21分别与YFP的N-端编码序列(n173)融合，构建同时表达E25-C155和RPL41-N173或P21-N173;同时表达E25-C155和N173;以及同时表达RPL41-N173或P21-N173和C155的重组病毒。将这些重组病毒分别感染Sf9细胞。共聚焦显微镜检测结果显示:E25与RPL41以及E25与P21双分子荧光互补分析的阴性对照组细胞中也呈现黄色荧光。 （三）AcMNPV E25与RPL41(或P21)免疫共沉淀分析: 分别用RPL41和P21抗体处理AcMNPV病毒感染后的Sf9细胞裂解液，Western-blot分析结果显示，在RPL41抗体的免疫沉淀物中同时存在E25和RPL41;在P21抗体的免疫沉淀物中同时存在E25和P21。这些实验结果表明E25与RPL41及P21之间存在相互作用。 （四）E25与乙醇脱氢酶(alcohol dehyrogenase，ADH)和eIF3G的GST-pull down分析: 将GST编码序列分别与ADH和eIF3G编码序列融合，分别构建表达GST-ADH或GST-eIF3G或GST的重组病毒并感染Sf9细胞。用GST亲和树脂处理病毒感染后的Sf9细胞裂解液。实验结果显示在三种重组病毒感染的细胞的pu1l-down样品中均有E25，表明E25与GST标签蛋白具有亲和性。 （五）e25截短突变体的构建及回交实验: 设计构建了14种e25截短突变体，将不同长度的截短片段克隆到pGBKT7载体上并分别与上述四种宿主蛋白基因cDNA克隆进行酵母双杂交回交实验，探究E25与四种宿主细胞蛋白的相互作用位点。

目录

声明

摘要

文章中的缩略词

1．1杆状病毒

1．1．1杆状病毒分类

1．1．2杆状病毒的病毒体

1．1．3杆状病毒的感染周期

1．2杆状病毒的分子生物学研究

1．2．1杆状病毒的核心基因

1．2．2杆状病毒的结构蛋白

1．3杆状病毒与宿主间的相互作用

1．4蛋白质相互作用研究方法

1．4．1酵母双杂交技术

1．4．2双分子荧光互补技术

1．4．3免疫共沉淀技术

1．5研究意义

2．1．1大肠杆菌菌株

2．1．2酵母菌菌株

2．1．4病毒与质粒

2．1．5酶与抗生素

2．1．6常用培养基

2．1．7常用溶液及缓冲液配方

2．1．8其他常用试剂与试剂盒

2．1．9引物合成与测序

2．2主要仪器设备

2．3本文所构建的重组质粒和病毒

3．1．1目的片段PCR

3．1．2 DNA胶回收试剂盒回收PCR产物

3．1．3碱裂解法提取质粒

3．1．4载体与目的片段的酶切

3．1．5酶切后的载体与目的片段回收

3．1．6载体与目的片段的连接

3．1．7质粒或酶连反应体系的转化

3．1．8酶切验证重组质粒

3．1．9 CaCl2处理法制备DH5α感受态

3．2转座及重组Bacmind验证

3．2．1转座

3．2．2重组Bacmid提取

3．2．3 PCR验证重组Bacmid

3．3细胞培养及转染感染实验

3．3．3病毒感染Sf9细胞

3．4非特异性抗体中和

3．5 SDS-PAGE与Western blot

3．6双荧光亚细胞共定位实验

3．7双分子荧光互补实验

3．8免疫共沉淀实验

3．9 GST-Pull down实验

3．10e25截短突变体的构建

3．11回交实验

3．11．1制备Y187感受态

3．11．2转化质粒进Y187感受态细胞

3．11．3回交探寻相互作用位点

4实验结果

4．1．2 AcMNPV E25与P21在Sf9细胞中的亚细胞定位结果

4．2 AcMNPV E25与RPL41及P21双分子荧光互补分析

4．2．2 AcMNPV E25与RPL41双分子荧光互补分析

4．2．3 AcMNPV E25与P21双分子荧光互补分析

4．3AcMNPV E25与RPL41及P21免疫共沉淀分析

4．3．2 AcMNPv E25与P21免疫共沉淀分析

4．4 AcMNPV E25与ADH及eIF3G GST-Pull down分析

4．4．1 GST-Pull down重组Bacmid的构建

4．4．2 AcMNPV E25与ADH(或eIF3G)GST-Pull down分析结果

4．5e25截短突变体的构建及回交

4．5．1e25截短突变体的构建

4．5．2回交结果

5讨论

参考文献

在校期间发表的论文

为本论文提供支持的国家自然科学基金项目

致谢