Wolbachia感染对果蝇精巢和雄附腺基因表达的影响

摘要

Wolbachia是一种专性胞内共生菌，广泛存在于无脊椎动物线虫和节肢动物中，高达70％的节肢动物种类都被其感染。Wolbachia对其宿主生殖的操控方式有多种，包括杀雄、雌性化、孤雌生殖(PI)、胞质不亲和(CI)等。其中CI是最常见的途径之一，它是依靠Wolbachia通过控制后代存活比率而形成的一种有利于雌性的生殖方式。当感染了Wolbachia的雄性与未感染或感染不同品系Wolbachia的雌性交配时，产生的后代就会出现CI，胚胎孵化率很低或为零。目前，对Wolbahia的研究已经很多，但大部分都是对其在分子检测和系统发生上的研究，对于其引起的CI机制的了解还不是很清楚。 在本实验中，以本实验组前期对感染和去除Wolbahia的黑腹果蝇在三龄幼虫精巢的基因芯片结果为基础，对挑选出的4个基因(CG7194、mdg4、chico和Sgs7)进行qRT-PCR验证，验证结果均为显著上调。说明Wolbachia可能影响雄性果蝇精巢的早期发育。然后通过qRT-PCR对CG7194基因在黑腹果蝇各发育时期的表达情况进行检测，发现CG7194在果蝇各发育阶段均表达，其中成蝇期显著高于其它时期，且在3d雄蝇中的表达量显著高于3d雌蝇，即具有偏雄性。推测Wolbachia可能促使CG7194表达量改变，对雄蝇的生殖系统的发育及生殖产生重要影响。 本实验还以研究组前期比较蛋白组结果为基础，从受Wolbachia感染后表达量发生变化的精子和精液蛋白中挑选了6种蛋白编码基因。以1d Dmel T和1d、5dDmel wMel的果蝇为实验对象，用qRT-PCR分别检测SP、Sfp53D、lectin-30A、CG11037、Rac1和Cdlc2在精巢和雄附腺中的表达量，发现Wolbachia感染导致这些基因中的大部分在精巢中的表达发生了显著变化:，P、lectin-30A和CG11037在黑腹果蝇的雄蝇精巢中表达均下调;Rac1和Cdlc2这两个基因在受感染的5d果蝇精巢中表达下调，并呈极显著差异(P＜0.01);Sfp53D则在感染的1d精巢中表达上调(P＜0.01)。而在雄附腺中，有4个基因的表达无显著变化。推测在果蝇雄附腺中，这些基因受到的影响较小，或者这些基因在交配期短时间内调控了蛋白的表达量。 从以上两次检测的候选基因中选取了4个基因（CG7194、Sgs7、CG11037和lectin-30A），成功地将其基因片段克隆到pUAST载体中。然后用胚胎显微注射技术将这些质粒注射到果蝇早期胚胎中，拟采用UAS-Gal4系统研究这些基因过量表达对果蝇生殖的影响，为研究Wolbachia诱导果蝇产生CI的分子机制及果蝇生殖的调控机制提供基础。

目录

声明

摘要

1前言

1．1果蝇雄性生殖系统相关研究

1．1．1果蝇精子发生相关基因的研究

1．1．2果蝇雄附腺相关基因的研究

1．2 Wolbachia研究概况

1．2．1 Wolbachia引起的CI

1．2．2 Wolbachia与宿主共同进化

1．2．3 Wolbachia在生物防治上的应用

1．3 UAS-Gal4系统在果蝇转基因中的原理及应用

1．4 CG7194等基因的概况

1．5本研究的目的及意义

2．1实验材料

2．2实验常用引物与试剂

2．3主要仪器设备

2．4实验方法

2．4．1普通果蝇培养基的配制

2．4．2果蝇胚胎收集盘的配制

2．4．3提取果蝇基因组DNA

2．4．4检测果蝇体内的Wolbachia

2．4．5果蝇RNA的提取、消化及cDNA的合成

2．4．6 qRT-PCR(实时荧光定量PCR)检测基因的表达

2．4．7CG7194时程表达分析

2．4．8注射用质粒的构建

2．4．9质粒的高纯度提取

2．4．10果蝇胚胎的显微注射

3结果

3．1检测果蝇体内感染Wolbachia情况

3．2 qRT-PCR对基因芯片结果的验证

3．2．1 cDNA质量检测

3．2．2基因芯片结果验证

3．2．3 CG7194在黑腹果蝇各发育时期的表达

3．3在精巢和雄附腺中对候选基因的检测

3．4转基因果蝇品系的构建

3．4．1基因全长的扩增

3．4．2显微注射果蝇胚胎

4讨论

4．1雄性生殖系统部分基因的检测

4．2果蝇显微注射

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢