光系统Ⅱ外周蛋白在集胞藻耐受氨毒害中的功能研究

摘要

随着人类生产活动程度的加剧，人为向环境中输出的氮素逐年增加，其中氨态氮占有重要份额。氨作为氮素营养常为植物优先利用，但浓度过高时也会影响生物的生理状态（尤其是光合放氧生物），甚至导致多样性下降、生态系统崩溃。蓝藻是全球初级生产力的重要贡献者，与高等植物光系统组成相近，研究其光合系统对氨毒害的响应可为植物对氨毒害的耐受机制提供理论参考，也为高浓度氨对生态系统的影响提供基础数据。外周蛋白PsbO、PsbU、PsbV、PsbP和PsbQ为蓝藻放氧复合体（Oxygen evolution complex，OEC）重要组成部分，具有维持放氧复合体活性、稳定光系统Ⅱ(PSⅡ)功能的作用，高温、高浓度尿素等处理能影响其与类囊体膜的结合，从而降低光合效率。前期研究表明OEC是氨对光系统Ⅱ毒害作用的起始位点，但OEC外周蛋白如何响应氨处理，以及其在耐受氨毒害中的作用还未见报道。 本研究以模式蓝藻—集胞藻PCC6803（Synechocystis sp.PCC6803）为研究对象，分别对五种OEC外周蛋白编码基因进行单敲除，通过比较各突变株及野生型藻株在梯度氨短期(1h)处理后PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)的变化，结合氨长期处理(48h)下各藻株的生长，发现突变株psbO-、psbU-和psbV-对氨毒害敏感性明显高于野生型藻株，通过基因的互补与超表达，分析氨处理对PSⅡ活性及生长表型的影响，证实PsbO、PsbU和PsbV在集胞藻耐受氨毒害中起到重要作用。快速诱导荧光动力学曲线显示，随着氨处理浓度的增大，psbU-和psbV-的300μs荧光增量逐渐增加，表明OEC受损程度逐渐加深;而psbO-在未施加氨处理时其本底荧光值已较高，表明缺失PsbO蛋白的藻株本身OEC受损程度很大。77K低温荧光显示，与野生型藻株相比，psbO-、psbU-和psbV-的PSⅡ荧光发射峰均出现不同程度的蓝移，表明缺少几种外周蛋白的PSⅡ不稳定;而氨处理1h后所有藻株PSⅡ发射峰均出现蓝移，表明氨处理损伤PSⅡ，使之解聚。氨处理野生型藻株1h，psbO和psbV基因表达在转录水平上略有下调，而psbU转录略显上调表达。20mmol L-1NH4Cl处理野生型藻株8、24、48和72h，免疫印迹结果表明PsbO蛋白含量在细胞内呈现下降趋势，具体表现在类囊体膜上的含量降低;而细胞内PsbU蛋白总含量以及可溶部分的蛋白含量，随着氨处理的时间的增长表现出增加的趋势，但类囊体膜上蛋白含量逐渐降低，表明氨处理影响PsbU与类囊体膜的结合，逐渐脱落至类囊体内腔;氨处理对PsbV蛋白在胞内的总含量及类囊体膜结合能力均影响不大。对野生型藻株1h氨处理表达谱结果分析表明，psbO、光合色素相关基因、ATP合酶及光系统Ⅰ(PSⅠ)绝大部分编码基因表达下调，而涉及PSⅡ修复循环的蛋白编码基因表达量上调，说明氨毒害使PSⅡ受损时，细胞降低PSⅠ的表达以及对光能的捕获，维持整个光合系统稳定的氧化还原状态，并且通过加速PSⅡ的修复来有效地降低光合损伤。 综合来讲，OEC外周蛋白PsbO、PsbU和PsbV对维持细胞在氨毒害过程中PSⅡ蛋白复合体的活性发挥重要作用。氨处理抑制PsbO在细胞内的表达，影响PsbU在类囊体膜上的结合，进而影响其对PSⅡ的保护作用。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1生态系统氮素循环

1．1生态系统氮素循环概述

1．2人类活动对地球氮素循环的影响

1．3氮沉降与氨沉降对生物的影响

1．4氨对植物的毒害机制

2蓝藻概述

2．1集胞藻PCC 6803概述

2．2蓝藻的遗传学背景

2．3 PSII外周蛋白研究现状

3本研究的目的和意义

第二章集胞藻PCC6803光系统Ⅱ外周蛋白在耐受氨毒害中的作用

1引言

2材料与方法

2．1藻株、菌株及培养条件

2．2集胞藻PCC 6803的基因组DNA的提取

2．3基因插入失活突变株的构建

2．4基因互补株、超表达株的构建

2．5遗传转化操作

2．6 PSII最大光化学效率的测定

2．7快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定

2．8 77 K低温荧光实验

2．9 NH4Cl母液的配制与藻株的氮处理

2．10粗膜的制备与蛋白组分的分离

2．11荧光定量PCR

2．12多克隆抗体的制备

2．13蛋白免疫印迹分析

3结果

3．1 psbO、psbU、psbV、psbP和psbQ基因插入失活突变株株构建

3．2基因插入失活突变株与野生型短期、长期氨处理敏感性

3．3 psbO、psbU和psbV基因互补株与超表达株的构建

3．4基因互补株、超表达株短期、长期氨处理敏感性

3．5不同浓度的氨处理对藻株叶绿素荧光快速诱导动力学曲线的影响

3．6生长状况下及氨处理后各藻株的77 K低温荧光

3．7氨处理下各基因转录水平的变化

3．8氨处理对外周蛋白表达量及与类囊体膜结合程度的影响

3．9转录组中光合作用相关基因的结果

4讨论

参考文献

在学期间撰写和发表的论文

致谢