小菜蛾颗粒体病毒晚期启动子在非受纳细胞系中的表达活性分析

摘要

杆状病毒是一类由囊膜包被杆状核衣壳的、含单一双链环状超螺旋基因组的病毒。小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus，PlxyGV）属于杆状病毒中的β-杆状病毒属。由于缺少合适的受纳细胞系，有关PlxyGV的分子生物学研究进展一直较为缓慢。本文通过小菜蛾颗粒体病毒的晚期启动子在非受纳细胞系中的表达活性分析，进一步研究制约PlxyGV离体复制的原因。 (1)通过基因克隆，构建由PlxyGV的晚期启动子(pxPan、pxPe18、pxPe25、pxPgp41、pxPp6.9、pxPvp39、pxPpk1、pxPgran、pxPorf21与pxPorf50)分别控制报告基因luciferase的10个报告质粒。通过瞬时表达实验我们发现，PlxyGV基因组不能在被转染的Sf9细胞中启动晚期与极晚期基因表达。同时我们也注意到，PlxyGV的晚期启动子报告质粒与AcMNPV共转染时均产生较高水平的荧光素酶活性。 (2)通过基因克隆，构建与PlxyGV报告质粒对应的由AcMNPV的晚期启动子(acPan、acPe18、acPe25、acPgp41、acPp6.9、acPvp39、acPpk1、acPpolh、acPp10)分别控制报告基因luciferase的9个报告质粒。通过瞬时表达实验，我们发现PlxyGV晚期基因报告质粒与AcMNPV DNA共转染细胞中的荧光素酶活性与对应AcMNPV晚期基因报告质粒和AcMNPV DNA共转染细胞中的荧光素酶活性接近甚至更高。 (3)利用Bac-to-Bac系统将由PlxyGV和AcMNPV晚期启动子控制的luc基因分别转座到AcMNPV bacmid bMON14272上构建相应的晚期基因报告病毒。通过转染后感染和实时表达分析，我们发现:在PlxyGV的非受纳细胞系Sf9细胞中，插入AcMNPV基因组的PlxyGV晚期启动子都能够被激活并驱动报告基因表达。其中，pxPgp41（或pxPgp41L）与acPgp41、pxPvp39（或pxPvp39L）与acPvp39、pxPe18与acPe18（或acPe18L）、pxPorf50与acPp10四组中，虽然对应启动子所含核心基元序列TAAG的数目可能相等，但它们的表达活性随时间变化的趋势差异显著。在pxPan与acPan、pxPpk1与acPpk1两组中，对应启动子在报告病毒感染细胞中的表达活性高低有明显差异，但它们随时间变化的趋势却基本相同。而acPp6.9与pxPp6.9、acPe25与pxPe25、acPpolh与pxPgran、pxPorf21与acPp10四组中对应启动子在重组病毒感染的细胞中的表达活性随时间的变化基本相同。 (4)通过λ-red同源重组的方法从AcMNPV基因组中分别敲除ie1、p35、lef8或vp39基因构成重组病毒vAcie1KO、vAcp35KO、vAclef8KO和vAcvp39KO。同时，利用Bac-To-Bac系统将含pF-pxPp6.9-luc与pF-pxPgran-luc的报告质粒分别转座到PlxyGV bacmid上，构成报告病毒vPxpxPp6.9-luc和vPxpxPgran-luc。通过瞬时表达实验，研究不同AcMNPV突变体(vAcie1KO、vAcp35KO、vAclef8KO和vAc39KO)对报告病毒中PlxyGV的晚期基因表达的影响。结果表明:在报告病毒vPxpxPp6.9-luc和vPxpxPgran-luc分别与vAcvp39KO共转染的Sf9细胞中均可检测到高水平的荧光素酶活性;在vPxpxPp6.9-luc和vPxpxPgran-luc分别与vAcie1KO共转染的细胞中荧光素酶活性仅略高于vPxpxPp6.9-luc和vPxpxPgran-luc单独转染细胞的荧光素酶活性。vPxpxPp6.9-luc与vAclef8KO或vAcp35KO共转染细胞中的荧光素酶活性分别是其与vAcvp39KO共转染细胞荧光素酶活性的0.98％和34.49％;而vPxpxPgran-luc与vAclef8KO或vAcp35KO共转染细胞的荧光素酶活性分别其与vAcvp39KO共转染细胞荧光素酶活性的0.29％和28.49％。这些结果说明:在被转染Sf9细胞中，由PlxyGV晚期启动子控制的报告基因的表达主要依赖于AcMNPV编码的RNA聚合酶;PlxyGV自身的晚期表达因子可能没有有效表达。 (5)为研究AcMNPV基因组对PlxyGV DNA复制的影响，用不同的PlxyGV bacmids单独或与AcMNPV的突变体共转染Sf9或Hi5细胞。从被转染细胞中提取的病毒DNA经DpnI处理后，以gp41为标的，通过PCR检测复制的PlxyGV DNA。无论是在Sf9细胞中还是在Hi5细胞中，PlxyGV的基因组均可以进行复制;AcMNPV的三种拯救因子ie1、p35和gp64可以增强其基因组的复制;在vAcef8O或vAc vp39KO存在的情况下，PlxyGV基因组的复制可进一步得到加强。

目录

声明

摘要

文中的缩写词

1．1杆状病毒

1．1．1杆状病毒的结构与分类

1．1．2杆状病毒的生活周期

1．1．3杆状病毒的基因表达

1．2杆状病毒晚期基因的表达

1．3 β-杆状病毒分子生物学的研究进展

1．4启动子的研究方法

1．4．1突变分析法

1．4．2瞬时表达分析

1．4．3稳定表达分析

1．5研究目的及其意义

2．1实验材料

2．1．1昆虫细胞系和病毒株

2．1．2大肠杆菌菌株

2．1．3常用质粒

2．1．4细菌培养基

2．1．5抗生素

2．1．6常用溶液

2．1．7酶、药品及其相关试剂

2．1．8所用载体

2．1．9实验中使用的引物

2．1．10实验中构建的重组质粒与重组病毒

2．2仪器设备

3．1重组质粒的构建

3．1．1引物设计

3．1．2目的片段扩增

3．1．3 DNA片段纯化回收

3．1．4酶切载体与目的片段

3．1．5乙醇沉淀回收目的片段

3．1．6片段和载体的连接

3．1．7大肠杆菌DH5a感受态的制备

3．1．8转化

3．1．9质粒的小量制备

3．1．10重组质粒的鉴定与菌种保存

3．2．3重组Bacmid的小量制备

3．3敲除型Bacmid的构建

3．3．1电转化感受态细胞的制备

3．3．2基因敲除

3．3．3敲除型Bacmid的验证

3．4细胞的转染

3．5细胞的感染

3．6荧光素酶活性检测

3．7瞬时表达实验

3．7．2细胞的共转染

3．7．3荧光素酶活性检测

3．8细胞中基因组的提取

4实验结果

4．1 PlxyGV晚期启动子表达活性的瞬时实验分析

4．1．1 10个PlxyGV晚期启动子序列分析

4．1．2 PlxyGV报告质粒的构建

4．1．3瞬时表达分析

4．2 PlxyGV与AcMNPV晚期启动子在AcMNPV bacmid转染的Sf9细胞中的表达活性的对比

4．2．1 AcMNPV晚期报告质粒构建

4．2．2瞬时表达分析

4．3插入AcMNPV基因组的PlxyGV晚期基因启动子在被感染细胞中的表达活性

4．3．1 PlxyGV和AcMNPV晚期基因报告病毒的构建

4．3．2 PlxyGV和AcMNPV晚期启动子在被重组病毒感染的Sf9细胞中的表达活性分析

4．4 AcMNPV突变体在共转染Sf细胞中对PlxyGV DNA复制和晚期基因表达的拯救作用

4．4．2 AcMNPV不同突变体在共转染细胞中对PlxyGV晚期基因表达的影响

4．4．3 AcMNPV bacmid不同突变体对PlxyGV DNA复制的影响

5讨论

参考文献

致谢