磁性纳米粒子的制备及其在拟南芥TIR1蛋白分离中的应用

摘要

除草剂靶标定位和分离鉴定是当前制约新型低毒高效化学除草剂发展的关键问题之一。建立简便快速准确的靶标分离鉴定方法对于除草剂靶标发现具有重要的意义。拟南芥TIR1蛋白是重要的生长素受体，也是重要的生长素型除草剂的作用靶标，近年来成为生长素信号转导网络研究的热点。本文合成功能化的磁性纳米粒子作为载体，采用免疫分离方法，初步研究了拟南芥TIR1蛋白的分离方法，为今后基于TIR1蛋白靶标的新型抑制剂研究奠定了基础。本论文工作主要分为以下三方面: 1.综述了与本论文相关研究内容的国内外研究进展，包括磁性纳米粒子的合成方法及应用，生长素的作用原理，TIR1蛋白，凝胶电泳及Dot blot的原理等，提出了本论文研究的课题设计。 2.合成了三种不同表面修饰的磁性纳米粒子。所采用的表面修饰剂分别是柠檬酸(Citric acid)、多巴胺(dopamine)、以及本课题组合成的末端带叠氮基的三功能聚合物(DSZ)。通过动态光散射(DLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、透射电镜(TEM)、以及Zeta电势测定等于段，对合成的磁性纳米粒子的表面形貌、微观结构等进行了表征。通过MTT比色实验，测定了磁性纳米粒子的细胞毒性。结果表明，合成的三种磁性纳米粒子水溶性较好，粒径分布比较均匀，毒性较小。 3.以HRP酶、HSA蛋白为例，建立磁纳米富集蛋白的模板反应。 4.采用TIR1蛋白一抗抗体，与表面羧基化的磁性纳米粒子共价键连接，得到磁性纳米粒子分离载体。培养拟南芥植株，获得拟南芥叶片、根部等不同组织的总蛋白提取液，在常温下与表面修饰有TIR1蛋白一抗抗体的磁性纳米粒子共孵育，利用免疫方法对TIR1蛋白进行磁性分离，经过Tris-HCl洗脱液洗脱、凝胶成像、及Dot blot进行表征。实验表明，拟南芥根部和叶子都含有TIR1蛋白，根部的含量多。在Tris-HCl洗脱且迅速调节pH后，Dot blot检测活性良好。 本论文工作建立了磁性纳米粒子分离提纯拟南芥TIR1蛋白的方法，为今后基于TIR1蛋白靶标的新型抑制剂研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1除草剂作用靶标研究的重要性

1．2现有的靶标蛋白的分离提纯方法

1．3磁性纳米粒子分离蛋白的方法

1．4磁性纳米粒子

1．4．1磁性纳米粒子的合成方法

1．4．2磁性纳米粒子的表面修饰

1．4．3磁性纳米粒子的应用

1．5拟南芥及植物生长素受体蛋白

1．5．1拟南芥

1．5．2植物生长素

1．5．3生长素的运输

1．5．4植物生长素受体蛋白

1．6变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．7固相免疫吸附

1．8论文课题设计

第二章三种磁性纳米粒子的合成及其表征

2．1引言

2．2实验部分

2．2．1实验试剂与仪器

2．2．2实验仪器

2．2．4制备Fe3O4-Critic acid

2．2．6三种不同修饰的磁纳米的表征

2．3结果与讨论

2．3．1磁纳米的傅里叶变换红外光谱

2．3．2磁纳米的动态光散射裹征

2．3．3磁纳米的TEM表征

2．3．4磁纳米的磁学表征

2．3．5磁纳米的稳定性试验

2．3．6磁纳米的MTT毒性试验

2．4本章小结

第三章磁性纳米粒子富集HRP酶及HSA蛋白的研究

3．1实验部分

3．1．1实验试剂

3．1．3Fe3O4-COOH与HSA一抗偶联，富集HSA

3．2结果与讨论

3．2．2磁性纳米粒子富集HSA结果

3．2．3磁性纳米粒子连接HSA一抗富集HRP二抗，洗脱效果

3．3本章小结

第四章磁性纳米粒子富集拟南芥根部蛋白TIR1

4．1引言

4．2实验部分

4．2．1实验试剂

4．2．2实验仪器

4．2．3拟南芥的培养与根部总蛋白的提取

4．2．4Fe3O4-COOH与TIR1一抗的偶联

4．2．5 Fe3O4-antibody富集拟南芥根部的TIRI蛋白

4．2．6 SDS-PAGE凝胶的制作

4．2．8 Dot blot

4．3结果与讨论

4．3．1四种腹水效价的Dot blot检测

4．3．2对于拟南芥根部，叶子及整体拟南芥总蛋白的提取

4．3．3对于提取的拟南芥根部，及富集后的蛋白定性定量分析

4．4本章小结

第五章全文总结

参考文献

致谢