美达霉素生物合成相关基因的功能研究

摘要

美达霉素是链霉菌产生的聚酮类抗生素，属于苯丙异色烷醌家族(benzoisochromanequinones)，具有抗菌和抗肿瘤活性。它结构中含有两个相反的手性中心(C13S/C15R)。本研究以美达霉素生物合成中的后期结构修饰基因med-ORF9和调控基因med-ORF10为对象，展开功能和机制研究，内容如下: （一）关于后期结构修饰基因med-ORF9的功能研究 根据GenBank公布的med-ORF9序列，同源性分析认为是编码烯酰还原酶的基因，推测参与美达霉素C15的R构型形成。 1.med-ORF9*的功能校正 以野生型美达霉素产生菌的基因组DNA为模板，通过PCR扩增med-ORF9基因，测序后发现该基因在野生菌中发生了无义突变（命名为med-ORF9*，相对于数据库中的med-ORF9），推测该基因功能已丧失，但该菌株中美达霉素依然产生，有可能med-ORF9*在美达霉素生物合成中已经不起作用（或不起主要作用）。为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能，我们开展了基因校正实验:通过基因合成、PCR及亚克隆等分子手段，获得一个与GenBank中序列完全一致的med-ORF9基因。修正后的目的基因克隆在整合型质粒pIJ8600上，构建了med-ORF9的超表达质粒;将该质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中，得到了med-ORF9的超表达菌株。对med-ORF9的超表达菌株与野生型菌株发酵产物进行HPLC及质谱分析，发现校正基因med-ORF9的超表达导致美达霉素量明显增加，而推测为美达霉素手性异构体的物质产量则减少，说明这个校正过的基因可能在美达霉素的手性结构形成中起重要作用。 2.med-ORF9*的敲除 为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能，本研究又进行基因敲除实验:以pYH7为载体构建了用于敲除med-ORF9*的自杀型质粒，将自杀型敲除质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中，筛选获得了med-ORF9*基因缺失突变菌株。将缺失突变株发酵产物进行HPLC分析，发现:与野生型菌株相比，缺失突变株还能产生美达霉素，说明这个发生点突变的基因已经丧失原来的烯酰还原酶功能。 3.med-ORF9的原核表达 为了进行体外酶学研究来验证med-ORF9的功能，我们对该基因进行原核表达:首先选择了pRSET(A)和pET-28a(+)作为原核表达载体，宿主菌为BL21(DE3)，构建了两组表达质粒:分别携带存在突变的med-ORF9*基因和修正了突变位点的med-ORF9基因。转入大肠杆菌宿主细胞进行诱导表达，并将表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测，发现存在突变的med-ORF9*基因不能表达，而修正了突变位点的med-ORF9的表达量虽然很低，但还可以检测到表达。 （二）调控基因med-ORF10的作用机制 med-ORF10是美达霉素生物合成途径中一个参与调控的小基因，前期研究显示该基因敲出后可降低美达霉素的产量，推测是个正调控基因，qRT-PCR分析显示med-ORF10的缺失突变对美达霉素基因簇上一个与手性中心形成相关基因med-ORF12的表达有显著影响。 4.调控基因med-ORF10作用机制的研究 为了进一步推测美达霉素基因簇中是否还有其它基因的表达受med-ORF10的调控，我们对野生菌和敲出菌中相关基因的转录进行了qRT-PCR分析。结果显示med-ORF10敲出后，基因簇中许多基因的表达量受到影响（如med-ORF1、med-ORF8、med-ORF11及med-ORF12）。然而与预期相反，在med-ORF1O敲出突变菌中，这些基因的表达量都有了不同程度的提高，如另一个正调控基因med-ORF11表达量提高了约70倍。为了验证med-ORF1、-ORF8以及-ORF12的转录是直接受控于med-ORF10还是直接受控于med-ORF11（有可能调控基因med-ORF11表达量的大量增加导致这几个基因表达量的升高），选取野生型菌株、med-ORF11敲出缺失菌株以及med-ORF11超表达菌株进行qRT-PCR验证。结果表明med-ORF11的过量表达不会导致相关基因表达量的大量增加。说明med-ORF10与美达霉素生物合成基因簇中某些基因的表达量改变直接有关，是美达霉素生物合成的调控基因。 5.med-ORF10表达的原位检测和初步Med-ORF10免疫共沉淀实验 前期实验中制备了med-ORF10的多克隆抗体，然而以此抗体检测野生菌株中该基因的表达情况时，没有检出预期的蛋白条带。为了提高检出该蛋白抗体的灵敏度，我们将Flag标签的编码序列连接在med-ORF10基因上，以整合型质粒pIJ8600为载体，构建了med-ORF10的融合蛋白表达质粒(pHSL115)，导入野生菌中。用Flag标签抗体进行检测，检出预期大小的目的蛋白。 为了进一步研究med-ORF0的调控机制，选择F1ag标签融合蛋白表达菌株AM161/pHSL115进行免疫共沉淀实验，同时选择缺失med-ORF10的突变菌株LJ作为阴性对照。免疫共沉淀实验中，并没有检测到Flag-med10蛋白与美达霉素生物合成相关的两个酶Med-ORF8（糖基转移酶）和Med-ORF12（酮基还原酶）有明显结合。可能Med-ORF10蛋白本身就不以与其它蛋白结合的方式行使调控功能，也可能Med-ORF10蛋白是与Med-ORF8和Med-ORF12之外的蛋白结合，具体机制还需进一步研究。

目录

声明

摘要

1．1链霉菌

1．2抗生素和美达霉素

1．2．1抗生素

1．2．2聚酮类抗生素

1．2．3美达霉素

1．3烯酰还原酶

1．4链霉菌次级代谢的调控

1．5本研究的内容和意义

2．1菌株

2．2质粒

2．3培养基

2．3．1大肠杆菌培养基

2．3．2链霉菌培养基

2．4试剂和溶液

2．4．1大肠杆菌质粒提取试剂

2．4．2链霉菌DNA的提取

2．4．4 Wbstern blot试剂

2．4．5缓冲液

2．4．6其他试剂

2．4．7酶和生化试剂

2．4．8抗生素

2．5实验方法

2．5．1碱裂解法提取大肠杆菌质粒

2．5．2大肠杆菌感受态细胞制备(cac12法)和转化(热激法)

2．5．3大肠杆菌菌种的保存

2．5．4 DNA的体外操作

2．5．5链霉菌的培养

2．5．6大肠杆菌与链霉菌的接合转移

2．5．7链霉菌的发酵

2．5．8发酵液的粗提取

2．5．9 HPLC及LC／MS分析[Ichinose K．et al．,2003]

2．5．11总RNA的反转录

2．5．12实时荧光定量PCR

2．5．13免疫共沉淀

第三章美达霉素生物合成后期修饰基因med-ORF9的功能研究

3．1．1超表达质粒的构建

3．1．2突变位点的校正

3．1．3超表达质粒的构建

3．1．4大肠杆菌与野生菌的接合转移

3．1．5超表达菌株的验证

3．2野生型菌株与超表达菌株的分析

3．3 med-ORF9缺失突变菌株的构建

3．3．1自杀型敲除质粒的构建

3．3．2通过结合转移将自杀型敲除质粒导入野生菌中

3．4 med-ORF9缺失菌的验证

3．5野生型菌株与缺失突变菌株的分析

3．6med-ORF9的原核表达

3．6．1med-ORF9原核表达质粒的构建

3．6．2初步诱导表达Med-ORF9蛋白

3．6．3更换表达载体构建表达质粒

3．6．4初步诱导表达Med-ORF9蛋白

3．7讨论

第四章美达霉素生物合成中一个调控基因作用机制的研究

4．1．1 qRT-PCR引物的设计

4．1．2RNA的提取

4．1．3 cDNA效果检测

4．1．4 qRT-PCR检测med-ORF10对相关基因表达的调控

4．1．5 qRT-PCR检测med-ORF11对相关基因表达的调控

4．2 med-ORF10的融合表达

4．2．1引物设计

4．2．2构建融合蛋白表达质粒

4．2．3大肠杆菌与AM7161的接合转移

4．2．4融合蛋白表达菌株的验证

4．2．5med-ORF10融合蛋白的表达

4．2．6med-ORF10融合蛋白的检测

4．3免疫共沉淀检测与Med-ORF10相互作用的蛋白

4．3．1样品的制备

4．3．2 Wbstem blot检测

4．4讨论

总结与展望

参考文献

硕士期间论文发表

致谢