武昌罗索线虫转录组测序及性别分化相关基因的功能分析

摘要

蚊类害虫不仅刺吸人血，更是多种疾病的传播媒介，对人类生产生活造成了极大危害。武昌罗索线虫（Romanomermis wuchangensis）寄生前期幼虫可侵染包括库蚊、伊蚊在内的多种蚊类孑孓，通过吸取宿主血淋巴内的营养物质来完成自身生长发育过程，最终从宿主体内脱出并造成宿主因血淋巴外流而死亡，是一种具有极大生物防治潜力的线虫资源。武昌罗索线虫具有特殊的性别分化机制:当每宿主体内寄生的线虫数目较少时，每条线虫相应获得的营养物质较多，则线虫更趋于发育成为雌虫;而当每宿主体内寄生的线虫数目较多时，每条线虫相应获得的营养物质较少，则线虫更趋于发育成为雄虫。然而在自然界中，武昌罗索线虫这一具有巨大生物防治潜力的线虫资源数量和分布范围有限，且对其进行体外培养发现该线虫的性别分化过程在体外条件下难以完成，表现为性别相关表征发育不成熟，很大程度上限制了该线虫资源的商品化生产并投入对蚊类害虫的实际防治应用中。目前，对于武昌罗索线虫这一生物防治材料的性别分化机制的研究相对较少，故深入研究其性别分化相关基因，不仅可为揭示该线虫的营养决定性别分化的分子机制提供科学数据，同时还能促进该线虫的大量体外培养研究。
　　本研究通过对武昌罗索线虫进行转录组测序，筛选得到了Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2等三个武昌罗索线虫的性别分化相关基因，并对这三个基因的表达模式和实际功能进行了初步的探究。通过对武昌罗索线虫寄生期3、4、5天，寄生后期1、3、5、7天和成虫期雌雄线虫以及怀卵雌虫体内的Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2三个基因的相对表达水平进行检测发现:(1)Rwucmab-3基因的相对表达量在寄生期3天雌雄线虫之间已出现显著性差异(p＜0.05)，早于Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因，推测武昌罗索线虫性别分化过程在寄生期3天已经启动;(2)寄生后期1天线虫的Rwuclaf-1基因的相对表达量显著高于其他发育时期雌雄线虫，根据秀丽线虫中关于laf-1基因的研究和武昌罗索线虫寄生后期线虫的发育特点，推测Rwuclaf-1基因在此时期的高表达与线虫的性腺及雌配子的发育成熟相关;(3)寄生后期1天雌线虫体内Rwuctra-2基因的相对表达量显著高于其它发育期雌线虫，根据秀丽线虫中关于tra-2基因的研究和武昌罗索线虫寄生后期线虫的发育特点，推测可能与雌线虫的性腺发育、配子形成等过程相关。
　　为了探究Rwucmab-3基因在线虫体内的实际表达部位，本研究对武昌罗索线虫的Rwucmab-3基因进行了原位杂交实验。实验结果显示:Rwucmab-3基因在寄生后期雌线虫尾部性腺卵母细胞中表达，推测Rwucmab-3基因与其在小鼠中的同源基因dmrt-1、果蝇中的同源基因dsx相同在卵母细胞内卵黄蛋白的合成过程中发挥作用。为了进一步探究Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因在武昌罗索线虫性别分化过程中发挥的具体作用，我们对以上三个基因进行了RNAi实验，结果显示:(1)Rwucmab-3 dsRNA浸泡组线虫相较于gfp dsRNA浸泡组和空白对照组其雌雄性比极显著提高(p＜0.01)，达到0.35±0.02;(2) Rwuclaf-1 dsRNA浸泡组和Rwuctra-2dsRNA浸泡组线虫相较于gfp dsRNA浸泡组和空白对照组其雌雄性比虽略有上升和下降，但其差异未达到显著水平（p＞0.05），推测可能与性别分化过程中基因互作复杂以及所选取目的基因dsRNA的位置和长度不合适相关。
　　综上所述，本研究首次对武昌罗索线虫进行了转录组测序并对测序所得数据进行了分析，为后续的武昌罗索线虫分子生物学相关研究提供了大量序列信息;更对武昌罗索线虫的性别分化相关基因Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2进行了表达和功能分析，实验结果为揭示武昌罗索线虫的性别分化的分子机制提供初步数据，有利于体外培养大量的性别分化成熟的武昌罗索线虫进而对蚊类害虫进行生物防治。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 武昌罗索线虫的生物学特性

1．2 蚊类的生物学特性及其危害

1．3 性别决定和性别分化

1．3．1 小鼠性别分化研究简介

1．3．2 果蝇性别分化研究简介

1．3．3 秀丽线虫性别分化研究简介

1．3．4 昆虫病原索科线虫的性别分化相关研究进展

1．4 本研究的目的及意义

2．材料与方法

2．1 实验材料、试剂和仪器

2．1．1 线虫及其宿主的来源与饲养

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 实验设计

2．2．2 感染实验

2．2．3 寄生期线虫的解剖

2．2．4 不同发育时期线虫材料RNA的提取

2．2．5 cDNA的反转录

2．2．6 荧光定量实验

2．2．7 FITC浸泡实验

2．2．8 dsRNA的制备

2．2．9 RNA干扰

2．2．10 原位杂交探针的制备

2．2．11 原位杂交

3 结果与分析

3．1 RNA的提取及cDNA的反转录

3．2 武昌罗索线虫的转录组数据分析

3．2．1 转录组测序及数据的组装

3．2．2 Unigene的功能注释

3．3 序列分析

3．4 感染实验

3．5 荧光定量实验

3．6 FITC浸泡实验

3．7 RNA干扰实验

3．7．1 dsRNA的合成

3．7．2 RNA干扰

3．8 原位杂交实验

3．8．1 原位杂交正义和反义探针的合成

3．8．2 原位杂交

4 讨论

4．1 武昌罗索线虫转录组测序数据的分析

4．2 武昌罗索线虫感染实验分析

4．3 武昌罗索线虫性别分化相关基因的序列、表达和功能分析

4．4 小结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢