等温滴定量热法和荧光淬灭法测定DPF2与抗癌药物的结合作用

摘要

DPF2是d4蛋白家族中成员之一。d4蛋白家族进化保守且结构相似，所有成员在结构上都包括一个N-端的结构域、中部的C2H2(Cys2His2)锌指结构域和C-端两个串联的PHD结构域。DPF2是一种重要的表观遗传修饰识别蛋白，其作为基因转录因子发挥作用，并且在细胞程序性死亡的发展中起着重要的作用。研究发现，人的DPF2基因定位于染色体的11q13位置，这一区域往往与多种形式肿瘤的发生有着密切的关系。人DPF2蛋白往往调控染色体11q13上肿瘤相关基因的表达，从而在肝癌、胃癌、白血病等恶性肿瘤的发生中起着重要作用，而它的C2H2锌指结构域又能识别并结合序列特异性的DNA和组蛋白，所以筛选人DPF2蛋白C2H2锌指结构域的抑制剂很有意义。
　　本实验选取DPF2 C2H2锌指结构域作为研究对象，挑选八种常见肿瘤治疗药物:顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、羟基脲、硼替佐米、地西他滨以及干扰素α，采用等温滴定量热法和荧光淬灭法来研究这八种肿瘤治疗药物与蛋白DPF2 C2H2的相互作用。
　　等温滴定量热法的实验结果表明顺铂是与DPF2蛋白C2H2结构域结合最好的药物，通过NanoAnalyze软件分析得到顺铂的结合常数Ka=1.76×105 L/mol，比其他结合药物大一个数量级，5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、羟基脲、地西他滨和蛋白也有结合作用，且都是一个结合位点，丝裂霉素、硼替佐米、干扰素α与蛋白没有结合。
　　荧光淬灭法进一步验证了这一结果，顺铂、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、羟基脲、地西他滨这六种药物均能够稳定淬灭DPF2 C2H2的内源荧光，而且顺铂与DPF2C2H2蛋白结合能力最强，结合常数Ka为1.58×106 L/mol，且结合位点n都大致为1，而丝裂霉素、硼替佐米、干扰素α不能稳定淬灭此蛋白的内源荧光，说明没有结合作用。
　　本研究是针对药物小分子与蛋白质的相互作用，运用了两种方法——荧光淬灭法和等温滴定量热法，通过这两种方法筛选结合最好的药物，其可能对由DPF2蛋白介导的肿瘤带来方便可靠的治疗，相关的研究也为探索d4家族其他蛋白的C2H2锌指结构域的功能做了铺垫。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 表观遗传修饰与d4蛋白家族

1．1．1 表观遗传修饰

1．1．2 d4蛋白家族与DPF2

1．2 肿瘤疾病与抗肿瘤药物

1．2．1 肿瘤疾病

1．2．2 抗肿瘤药物

1．3 蛋白质与药物小分子之间相互作用的研究方法

1．3．1 毛细管电泳法

1．3．2 高效亲和色谱法

1．3．3 高效前沿分析法

1．3．4 微透析法

1．3．5 等温滴定量热法

1．3．6 荧光光谱法

1．3．7 超滤法

1．3．8 表面等离子共振技术

1．3．9 其他研究方法

1．4 本课题的研究目的和意义

第二章 材料及方法

2．1 仪器与实验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验菌株和质粒

2．1．4 实验试剂的配制

2．1．5 主要分子生物学数据库和软件

2．2 实验方法

2．2．1 DPF2 C2H2蛋白的生物信息学分析

2．2．2 DPF2 C2H2蛋白的表达及纯化

2．2．3 等温滴定量热法研究DPF2 C2H2蛋白与抗癌药物的结合作用

2．2．4 荧光淬灭法研究DPF2 C2H2蛋白与抗癌药物的结合作用

第三章 结果与分析

3．1 目的蛋白DPF2的生物信息学分析

3．1．1 分析DPF2的基本性质

3．1．2 分析目的蛋白DPF2的疏水性、跨膜区、信号肽、二级结构组成及关键结构域

3．1．3 蛋白DPF2的氨基酸序列比对

3．2 目的蛋白DPF2 C2H2的表达及纯化

3．3 等温滴定量热法研究目的蛋白DPF2 C2H2与抗癌药物的结合作用

3．4 荧光淬灭法研究蛋白DPF2 C2H2与抗癌药物的结合作用

3．4．1 确定蛋白DPF2 C2H2的发射波长和激发波长

3．4．2 荧光淬灭法研究蛋白DPF2 C2H2与抗癌药物的结合作用

3．4．3 抗癌药物与蛋白DPF2 C2H2相互作用的标准曲线图

第四章 讨论与总结

4．1 荧光淬灭法和等温滴定量热法的优势

4．2 讨论

4．3 总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附录

致谢