黄瓜花叶病毒M株系侵染性cDNA克隆的构建及3a基因的原核表达

摘要

以感染黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)M株系的白肋烟为材料，提取植物总RNA，通过反转录合成cDNA，通过PCR扩增分别获得了CMV-M基因组3段全序列-RNA1、RNA2和RNA3。构建了噬菌体T7RNA聚合酶启动子控制下的CMV-M三段全长cDNA克隆pUC-1、pUC-2和pUC-3。序列分析表明CMV-M RNA1全长3361个核苷酸，含有一个开放阅读框架(ORF1)，编码分子量为112ku的1a蛋白。5'NTR长93nt，3'NTR长222nt；RNA2全长3037个核苷酸，含有两个开放阅读框架(ORF2，3)，编码分子量为96.7ku的2a蛋白以及分子量为13.1ku的2b蛋白。5'NTR长87nt，3'NTR长299nt。CMV-M RNA3全长2215个核苷酸，含有两个开放阅读框(ORF4，5)，分别编码分子量为31ku的3a蛋白和分子量为24ku的外壳蛋白(CP)。5'NTR长120nt，3'NTR长289nt。 将CMV-M全长基因组cDNA分别克隆至pUC18载体中得到pUC-1、pUC-2和pUC-3。将重组质粒pUC-1、pUC-2和pUC-3用限制性内切酶SphⅠ线性化，以该线性化产物为模板进行体外转录，体外转录物混合摩擦接种于白肋烟表明具有侵染性，接种在叶片上产生与野生型病毒接种相同的花叶症状，同时可以在接种植物中检测到病毒RNA。 为近一步研究CMV-M3a基因与病毒致病性间的关系，利用CMV-M RNA3全长cDNA克隆构建了运动蛋白MP(3a基因编码的移动蛋白)的原核表达载体。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，MP基因在大肠杆菌BL21中高效表达。

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论文说明：缩略语

声明

1文献综述

1.1黄瓜花叶病毒的研究进展

1.1.1症状表现

1.1.2株系划分

1.1.3基因组结构

1.1.4黄瓜花叶病毒国内外研究进展

1.1.5黄瓜花叶病毒M株系国内外研究概述

1.2侵染性克隆的研究进展

1.2.1侵染性病毒研究进展

1.2.2.侵染性克隆与病毒分子生物学

1.2.3侵染性克隆的种类

1.2.4侵染性克隆构建的策略

1.2.5侵染性cDNA克隆的应用

1.3本课题研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1毒原的采集及保存

2.1.2接种方式

2.1.3菌株和质粒

2.1.4生化及分子生物学试剂

2.1.5寡聚核苷酸引物

2.1.6所用仪器

2.2方法

2.2.1植物总RNA的提取

2.2.2 RT-PCR

2.2.3 PCR扩增

2.2.4 PCR产物的纯化

2.2.5连接反应

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.7连接产物转化大肠杆菌

2.2.8碱裂解法提取质粒DNA

2.2.9序列分析

2.2.10全序列cDNA重组载体的构建

2.2.11体外转录

2.2.12摩擦接种及症状观察

2.2.13含CMV-M-3a基因的原核表达载体的构建

2.2.14 CMV-M-3a基因的诱导表达

2.2.15表达产物的SDS-PAGE分析

3结果及分析

3.1 CMV-M侵染现象的观察结果

3.2 CMV-M的基组全序列及分析

3.2.1 CMV-M基因组全序列PCR的扩增

3.2.2 CMV-M基因组核苷酸全序列分析

3.2.3小结

3.3 CMV-M侵染性cDNA克隆的构建及侵染性检测

3.3.1 CMV-M全序列cDNA克隆的构建

3.3.2体外转录和摩擦接种

3.3.3体外转录物侵染性的RT-PCR检测

3.3.4讨论

3.4 3a Gene的原核表达

3.4.1 3a基因片断的PCR扩增

3.4.2 pET22b-MP重组表达载体的构建

3.4.3融合蛋白表达的检测

3.4.4讨论

4讨论

5结论与展望

参考文献

致谢

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