棉花离体培养再生体系的研究及抗黄萎病转基因棉花植株的培育

摘要

细胞工程和基因工程的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。植物抗病基因工程是植物基因工程的一个分支，它是将外源抗病基因通过各种遗传方法导入到植物基因组中并培育抗病品种。棉花是我国第一大经济作物，棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”，本研究以湖南重要的优良品种湘棉10号、湘棉15号为研究材料，采用花粉管通道法将溶菌酶基因导入两品种均获得了抗黄萎病的棉花植株，同时进行了湘棉10号离体培养再生体系建立的研究为农杆菌介导转化外源基因奠定了基础。研究结果如下： 1. 湘棉10号再生体系建立的研究 (1)外植体类型是影响棉花愈伤组织诱导的重要因素。不同外植体在相同激素组合下，愈伤诱导率不同。湘棉10号的愈伤组织诱导率大小顺序为下胚轴>子叶>胚根。 (2)以下胚轴为外植体，通过愈伤组织的诱导、继代和分化，摸索出愈伤组织的诱导、继代和分化的最适基本培养基是MSB：愈伤组织的诱导、继代和分化的最适碳源是葡萄糖：最适诱导、继代和分化培养基为MSB+ZT0.1mg/L：不同培养基和激素配比的成苗率不同，SH+IAAO.2mg/L+KT0.2mg/L成苗率最高达13.6％：生根的最适培养基是Ms+Ihh0.1mg/L，生根率高达100％。 (3)愈伤组织的诱导和继代表明，愈伤组织形成的快慢、多少与激素、外植体种类、温度和基因型有关。2，4-D的添加有利于愈伤组织的诱导和形成但未能直接诱导获得胚性愈伤组织，ZT的单独使用则可直接诱导获得少量的胚性愈伤组织；同时研究表明温度影响愈伤组织的诱导，最适温度为28℃左右。 (4)在防褐的研究中发现对基本培养基的改良，选择适宜的激素组合以及添加防褐物质如活性碳，PVP等都对降低愈伤组织的褐化有明显的作用。KT+6-BA激素组合可以明显降低褐化，而KT、IAA、6-BA三种激素的单独应用效果对愈伤组织的褐化改善不明显。 2. 花粉管通道法获得转溶菌酶基因植株 以湘棉10号、湘棉15号为研究材料，采用花粉管通道法将溶菌酶基因导入，在遗传转化中，摸索出了该方法转化的较佳位置是从果枝第2果台开始至第6果台，转化时间应选择开花约24小时的自交棉花进行注射，其成铃率较高而且收获的拟转化种子数量最多，注射方式以对准中轴胎座的中部位置垂直插入子房最佳，其转化率达9％而且此种注射方式减少对子房的伤害提高了成铃率。采用抗生素筛选最后筛选得到23株抗卡那霉素湘棉10号植株和9株抗G418湘棉15号植株。经分子生物学方法PCR，PCR-SOUTHERN检测，结果发现：23株抗卡那霉素湘棉10号植株中1株不含选择标记基因NPTⅡ只含溶菌酶基因，同时获得4株只含选择标记基因不含溶菌酶基因植株，证实其他18株转溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和选择标记基因NPTⅡ均已整合在棉花基因组中，9株抗G418的湘棉15号植株中2株只含选择标记基因不含溶菌酶基因植株，证实其他7株转溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和选择标记基因NPTⅡ均已整合在棉花基因组中。 3. 转基因植株初步的抗性测试 采用菌液浇根法和针刺叶片喷洒法两种方法对转基因植株进行初步的抗黄萎病的抗性测试，黄萎病菌株由河北植保所提供，菌株培养后对转基因植株和对照植株的根或叶片进行处理，然后观察统计，两种方法的实验结果都表明经菌处理后转基因植株生长正常，而对照植株叶片先出现褐斑，然后变黄枯萎，而且生长状态差，几乎不生长。初步表明转溶菌酶基因的棉花植株对黄萎病具有抗性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1 npf-Ⅱ基因和溶菌酶基因的概述

1.1 npf-Ⅱ基因的筛选机理及应用

1.2溶菌酶及其应用

2棉花花粉管通道法概述

2.1花粉管通道法的机理

2.2花粉管通道法的优缺点

3棉花再生体系建立的研究现状

3.1材料的选择

3.2外植体的选择

3.3培养条件

3.4愈伤组织的诱导及继代增殖

3.5胚性愈伤组织的分化和植株再生移栽

4棉花黄萎病的研究进展

4.1棉花黄萎病的致病情况及危害

4.2棉花黄萎病的防治措施

4.3棉花抗黄萎病新品种选育进展

4.4棉花抗黄萎病的分子育种

5本课题立项依据和研究目的

第二章棉花离体培养再生体系建立的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2培养基

1.3方法

1.4培养条件

1.5统计方法

2结果与分析

2.1愈伤组织的诱导、继代和分化培养

2.2组织培养中降低褐化的研究

3小结与讨论

3.1激素对愈伤组织的诱导和继代影响

3.2胚性愈伤组织的形成是植株再生的关键

3.3降低褐变是棉花组织培养成功的重要方面之一

3.4植株再生过程中有待解决的问题

第三章花粉管通道法获得转溶菌酶基因棉花植株

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1棉花的遗传转化

2.2抗生素筛选转基因植株

2.3转基因棉花分子生物学鉴定

3.3PCR-SOUTHERN结果

3 讨论

3.1棉花的遗传转化方法

3.2选择适宜的卡那霉素浓度是卡那霉素浸种筛选转基因棉花的关键

3.3棉花总DNA的提取优化

3.4转溶菌酶基因棉花中外源基因的分子鉴定及其整合特点

第四章 转基因植株抗黄萎病的初步鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

附图

致谢

作者简介