放线菌HNS2-2的分离、鉴定及抗烟草花叶病毒活性产物的研究

摘要

植物病毒病是农业生产中发生普遍、危害严重的一类病害，每年给农业生产带来很大的经济损失。现有的化学药物对植物病毒病的防治效果不佳，且对生态环境、人畜生存质量有负面影响。植物源农药因植物资源有限、成本高、效果不稳定等因素，难以商品化生产。因此，筛选、开发微生物源抗植物病毒活性物质是防治植物病毒的主要研究方向。 放线菌(Actinomycetes)是与人类关系极为密切的一类微生物，它们广泛存在于不同自然生态环境中，可以产生多种抗生素及非抗生素类活性产物，应用于人类细菌病、真菌病、寄生虫病、肿瘤甚至病毒病的防治。放线菌中以链霉菌合成抗生素次生代谢产物的能力最强，放线菌产生的抗生素中有90％是以链霉菌作为生产菌种生产的。现已从链霉菌中得到土霉素、金霉素、氯霉素、红霉素等氨基糖苷类、大环内酯类、多烯类、聚醚类抗生素。但对于防治植物病害的抗生素，尤其是抗植物病毒的活性物质，却很少报道。 本文从土壤放线菌的分离、抗TMV菌株的筛选、菌株的鉴定、摇瓶发酵条件的优化以及活性物质追踪分析等方面进行了系统研究，结果如下： 1)为了提高土壤中放线菌的分离效率，解决放线茵分离培养中真菌、细菌污染问题，采用多种分离培养基和不同浓度抑制剂，从土壤样品中选择性分离放线菌，试验结果表明，土样于90℃条件下加热处理1h，在10倍稀释的土壤悬浮液中，加入0．05％SDS，于40℃振荡20min后，用稀释平板涂布法接种于含有重铬酸钾(质量浓度为100mg/L)高氏1号培养基平板上，28℃培养6、7d，生长的放线菌数量多，且细菌、真菌数量少，最适于放线菌分离。采用此种方法从117份土样中分离得到放线菌菌株413个。 2)采用摩擦接种法接种烟草花叶病毒(TMV)系统侵染寄主普通烟草K326、枯斑寄主曼陀罗，反复筛选，得到具有抗TMV活性的放线菌菌株HNS2-2。 3)通过对HNS2-2菌株进行培养性状、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列的测定及其系统发育分析的研究，表明HNS2-2为一种链霉菌，与草绿色链霉菌的模式菌株S.herbaricolor strain NRRL B-3299T的序列同源性为100％，因此归入草绿色链霉菌，16S rDNA序列已在GenBank注册，登录序列号为EU035296。 4)进行摇瓶发酵培养基筛选、发酵温度、初始pH、接种量、装液量、种龄、发酵时间等条件优化，得出发酵培养基为10％大米粉、2.2％黄豆粉为主要成分，最佳发酵条件为取种龄24h按接种量8％接种，在初始pH7.2-7.4、30℃、220r/min条件下进行摇瓶发酵培养。 5)在对新菌株HNS2-2抗病毒活性物质的研究中，通过对发酵液进行加热酸化预处理、蒸发浓缩、透析分离、乙酸乙酯萃取逐级分离和活性追踪分析，得知HNS2-2活性物质为小分子脂溶性复合物。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1链霉菌及其抗生素

1.1链霉菌的基本特点

1.2链霉菌产生的抗菌素

2农用抗生素的开发研究方法

2.1抗生素的一般开发模式

2.2农用抗生素开发研究要点

3微生物抗植物病毒剂研究进展

3.1微生物抗植物病毒活性物的来源

3.2微生物抗植物病毒物质的作用机制

3.3微生物抗植物病毒物质的筛选方法

3.4开发微生物抗植物病毒物质的展望

4本论文的目的与意义

第二章抗病毒活放线菌菌株的分离筛选

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1土壤放线菌菌株的分离、纯化结果及分析

2.2抗病毒放线菌的初筛结果

2.3抗病毒放线菌的复筛结果

3小结与讨论

3.1小结

3.2讨论

第三章抗TMV放线菌的分类鉴定

1材料与方法

1.1主要试剂与溶液

1.2主要仪器

1.3供试菌株来源

1.4培养基

1.5形态培养特征观察

1.6生理生化特性鉴定

1.7 16S rDNA序列测定及系统发育分析

2结果与分析

2.1 HNS2-2形态及培养特征

2.2生理生化特征

2.3 16S rDNA序列分析

2.4菌株HNS2-2鉴定结果

3小结与讨论

3.1小结

3.2讨论

第四章HNS2-2菌株发酵条件的优化

1材料与方法

1.1主要试剂

1.2主要仪器

1.3试验菌株来源

1.4培养基

1.5活性物质检测指示菌的筛选

1.6碳源、氮源对菌株HNS2-2产活性物质的影响

1.7培养条件对菌株HNS2-2产活性物质的影响

2结果与分析

2.1活性物质检测指示菌的筛选

2.2碳源、氮源对菌株HNS2-2产活性物质的影响

2.3培养条件对菌株HNS2-2产活性物质的影响

3小结与讨论

3.1小结

3.2讨论

第五章HNS2-2生物活性物质的活性追踪研究

1材料和方法

1.1材料

1.2TMV提纯程序

1.3预处理发酵液的活性测定

1.4预处理发酵液的透析分离及活性测定

1.5透析外渗液的萃取分离及活性测定

2结果与分析

2.1不同预处理对发酵液抗病毒活性的影响

2.2发酵液中大小分子复合物的抗病毒活性比较

2.3萃取分离物的抗病毒活性比较

3小结与讨论

3.1小结

3.2讨论

第六章结论与创新点

1结论

2创新点

参考文献

致 谢

作者简历

附 录