根癌农杆菌介导的Bt与GNA基因转化菊花品种的研究

摘要

通过该研究,获得的结果如下:⒈建立菊花9个品种高效稳定的再生体系以9个菊花品种为试材,利用6种分化培养基和3种生根培养基,以叶片、节间茎段为外植体,研究不同基因型、激素组合以及附加不同浓度的AgNO<,3>对建立高效、快速、经济的再生体系建立的影响.⒉建立菊花品种'日本黄'农杆菌介导的遗传转化体系以菊花品种'日本黄'为材料,取节间外植体,在分化培养基D<,5>(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L,pH6.0)上预培养2d.将节间外植体在含GUS基因的pBⅠ121的根癌农杆菌菌液中浸泡10min后,在共培养培养基C<,1>(1/2MS+NAA0.5mg/L,pH5.6)上暗培养2天,保持温度为23℃.⒊转Bt基因菊花抗虫植株的获得在国内首次用转Bt的CrylAc基因获得菊花的抗虫植株.以茎节间段为外植体用农杆菌介导法,将苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白CrylAc基因导入菊花(切花菊)品种'日本黄'中,得到126株健康抗性植株,通过PCR初选,阳性植株进行基因组DNA的Southern杂交证明CrylAc基因已整合到菊花基因组中,共获得6株转基因植株,转化率为4.8﹪.⒋转雪花莲外源凝集素基因(GNA)菊花抗菊姬(小)长管蚜我们首次转GNA(Galanthus navies agglutinin,snowdrop)基因获得菊花的抗菊姬(小)长管蚜(Macrosiphoniella sanborni)植株.

目录

Abstract

缩略词表

1文献综述

1.1引言

1.2植物抗虫基因工程研究进展

1.2.1Bt毒收蛋白基因及转Bt基因植物的获得

1.2.2雪花莲外源凝集素基因（GNA）及转GNA基因植物的获得

1.2.3其它抗虫基因

1.2.4多抗虫基因工程

1.2.5抗虫转基因植物目前存在的问题和对策

1.3花卉转基因研究进展

1.3.1花卉花发育及开花基因的研究

1.3.2花色基因工程与转基因研究

1.3.4花卉香味基因工程与转基因研究

1.3.5花卉抗衰老和保鲜基因工程以及转基因研究

1.3.6调节花卉花期基因工程和转基因研究

1.3.7花卉的抗性基因工程

1.3.8花卉品质改良基因工程

1.3.9花卉转基因存在的问题和对策

1.4菊花转基因研究进展

1.4.1菊花遗传转化体系的建立

1.4.2菊花遗传转化的目的的基因

1.4.3问题与展望

1.5本课题研究的目的意义和内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菊花材料

2.1.2农杆菌和植物表达载体

2.1.3试验昆虫

2.1.4酶、生化试剂和引物

2.1.5培养基及培养条件

2.2方法

2.2.1菊花9个品种的快速高效再生体系的建立

2.2.2菊花高效稳定转基因体系的优化

2.2.3Bt基因在菊花中转化

2.2.4GNA基因的菊花中转化

3结果与分析

3.1菊花9个品种的快速高效再生体系的建立

3.1.1不定芽的分化

3.1.2AgNO3对再生的影响

3.2.3生根和移载成苗

3.2菊花高效稳定转基因体系的建立

3.2.1卡那霉素选择压力的确定

3.2.2不同菊花品种之间对转基因效率的影响

3.2.3头孢霉素对菊花再生的影响

3.2.4预培养对菊花再生的影响

3.2.5不同农杆菌浓度和不同侵染时间对菊花再生的影响

3.2.6不同共培养培养基对菊花再生的影响

3.2.7不同共培养培养基pH值对菊花再生的影响

3.2.8不同共培养时间、不同共培养温度及是否添加乙酰丁香酮对菊花再生的影响

3.2.9程序化的菊花品种‘Y1’转基因操作体系及体系效率的验证

3.2.10菊花品种‘Y1’不同外植体转基因植株比较

3.3菊花转Bt基因植株的获得

3.3.1菊花的卡那霉素抗性植株的获得

3.3.2菊花基因组DNA提取

3.3.3转化植株的PCR检测

3.3.4转化植株的Southorn杂交验证

3.3.5转基因菊花植株对棉铃虫具有高抗性

3.4.1菊花的卡那霉素抗性植株的获得

3.4.2转化植株的PCR检测

3.4.3转化植株的Southern杂交验证

3.4.4转基因菊花植株对菊姬（小）长管蚜具有高抗性

4讨论

4.1菊花9个品种的快速高效再生体系的建立

4.2影响农杆菌介导的菊花转基因体系的因素

4.2.1筛选抗生素的种类和浓度

4.2.2不同的菊花品种类型

4.2.3共培养条件的选择

4.2.4关于转基因体系的建立评价

4.3菊花转Bt基因植株的获得

4.3.1菊花基因组DNA提取

4.3.2菊花转Bt和GNA基因的假转化体问题

4.3.3菊花转Bt和GNA基因植株的抗虫问题

4.3.4菊花转多抗虫基因问题

参考文献

图版与说明

附录

致谢