胸膜肺炎放线杆菌血清学分型和基因分型的研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的病原,该试验中,将引进的胸膜肺炎放线杆菌13种血清型标准菌株,在TM/SN培养基上增殖,收获菌体,灭活后用于免疫家兔,制备了分型血清.分别应用玻片凝集试验、琼脂扩散试验和免疫电泳试验,对抗血清的特异性、效价和保存期进行了监测,结果表明,制备的抗血清有较好的特异性,在4℃下保存1个月、-20℃下8个月和-80℃下1年其效价无明显变化.用制备的分型血清采用琼脂扩散试验对PCR阳性的胸膜肺炎放线杆菌地方分离菌株进行了鉴定,分别为血清2、3和8型,说明抗血清可用于分离菌株的鉴定分型.为了能通过检测送检血清了解动物感染病原的血清型,将增殖并收获的胸膜肺炎放线杆菌13个血清型标准菌株,采用洗涤直接离心、超声波处理和酚抽提等方法,制备不同血清型抗原,通过玻片凝集试验、琼脂扩散试验和对流免疫电泳,以标准抗血清作为参考,评价各种诊断抗原的特异性和灵敏性.分别应用研制的3种抗原对来自湖北、湖南、江西、河南和安徽等五省的155份送检血清进行检测,初步结果表明定型抗原及其检测方法能准确地进行血清学鉴别诊断和血清分型.基因分型是近几年来用于细菌分型的新技术,能克服经典的血清学分型方法对部分菌株不能进行分型的缺点,已经应用于其它细菌的分型.该研究中,根据胸膜肺炎放线杆菌各血清型之间某些毒力相关因子的基因差异,设计不同的引物,分别对各血清型外毒素(Apx)、外膜蛋白(OmlA)、转铁蛋白B(TbpB)进行PCR扩增,得到不同的特异性片段,可区分胸膜肺炎放线杆菌生物Ⅰ型13个标准菌株血清型中的8个血清型,建立了基因分型方法,常见病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、波氏杆菌和链球菌在apx-PCR中不能扩增出特异性片段.对分离的12株野生菌用此方法进行分型,其结果与常规的血清学分型结果一致,为血清2、3和10型.将此分型系统用于临床送检的126份肺脏和42份扁桃体检测,结果表明,可直接检测出胸膜肺炎放线杆菌感染,并能判定感染病原的血清型.该方法还可以将一些尚未定型的菌株进行归类,弥补了血清学方法的不足,而且,缩短了诊断的时间.总之,该研究制备了13个血清型的胸膜肺炎放线杆菌分型血清和诊断抗原,提出了适用的血清学检测方法;在分子水平上,建立了胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法,结果与经典的血清学分型方法相符,同时还弥补了经典的血清学方法对部分分离株不能分型的不足.这些方法为进一步开展病原分离鉴定、血清流行病学和分子流行病学提供了有效的手段.

目录

摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1病原学

1.2流行病病学

1.3致病因子

1.3.1外毒素

1.3.2脂多糖

1.3.3荚膜多糖

1.3.4转铁结合蛋白

1.4致病机理和病理变化

1.5胸膜肺炎放线杆菌血清型的鉴定方法

1.5.1胸膜肺炎放线杆菌血清学分型

1.5.2胸膜肺炎放线杆菌的基因分型

1.6细菌分型方法展望

1.6.1质粒DNA指纹图谱

1.6.2 PCR及其相关技术

1.6.3脉冲场凝胶电泳

1.6.4限制性内切酶多态性分析(Restyrion Fragment Length PolymorphismRFLP)

第二章研究的目的和意义

第三章胸膜肺炎放线杆菌血清学分型方法的建立和临床应用

3.1材料和方法

3.1.1标准菌株

3.1.2培养基的制备

3.1.3试验动物

3.1.4检测抗原和免疫原的制备

3.1.5抗血清的制备及其特性的检测

3.1.6临床初步应用

3.1.7人工感染猪的检测

3.1.8诊断抗原的临床检测

3.2结果

3.2.1抗血清制备及特性测定

3.2.2抗原特异性检测

3.2.3人工感染猪的检测

3.2.4野外分离菌株的血清型鉴定

3.3讨论

第四章胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法的建立和临床应用

4.1材料和方法

4.1.1实验菌株及培养条件

4.1.2模板的制备

4.1.3基因分型的PCR反应体系

4.1.4临床病料的检测

4.2结果

4.2.1标准菌株在PCR分型系统中的结果分析

4.2.2病原菌的分离和血清型的鉴定

4.2.3临床病料的病原学检查

4.3讨论

结论

参考文献

致谢

附录