猪传染性胸膜肺炎ELISA诊断方法的建立及初步应用

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)的致病菌,该病是一种呼吸道疾病,影响着全世界养猪业的发展.猪感染此病后会呈现从急性的突然死亡到慢性感染及亚临床感染等症状.急性感染可表现为肺的纤维素性、出血性坏死,死亡率高;慢性感染的猪无明显的临床症状但生长缓慢.发病后存活下来的猪可成为病原的携带者,从而可能引起此病的再次爆发.所以,猪群APP血清抗体的检测对预防和控制该病的爆发具有十分重要的意义.迄今为止,已报道的APP血清型共有15种,不同血清型之间没有或仅有弱的交叉反应,这给该病的诊断和预防带来了很大的困难.传统的血清学诊断方法,如CFT、IHA等,针对的是菌体抗原诱导产生的抗体,只能对同血清型的APP做出检测.免疫预防也存在着同样的问题,APP的灭活苗具有一定的保护力,但是,也只能对同血清型APP的感染产生保护.该研究主要是针对以上情况,旨在建立一种特异、敏感、能对所有血清型APP做出检测的血清学检测方法.由于胸膜肺炎放线杆菌的毒素和转铁结合蛋白具有种特异性,所以有希望用于APP诊断方法的建立.将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的质粒pET-Apx Ⅱ转化到大肠杆菌BL21(DE3).挑选出表达量最高的克隆子,然后于37℃经IPTG诱导表达.对表达条件进行优化,并对包涵体进行了变性和复性.用复性后的蛋白作抗原,建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA).与间接血凝(IHA)检测结果作了比较,证明所建立的ELISA诊断方法具有较高的特异性和敏感性,并具有良好的稳定性和可重复性.利用建立的Apx Ⅱ-ELISA诊断方法对2503份临床送检的各地猪血清进行检测,测得猪传染性胸膜肺炎的阳性率平均为63﹪以上.利用地方分离的APP血清型2型菌株,设计一对引物,用PCR的方法扩增了其转铁结合蛋白A基因(tbpA基因),扩增片段的大小为2726bp,并克隆到pET-28b中构建了重组表达载体.经酶切鉴定及测序分析后,将此表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,SDS-PAGE和Western blotting结果表明该基因在大肠杆菌BL21中获得了表达.表达的蛋白经纯化后建立了Tbp-ELISA检测方法,并与IHA和Apx Ⅱ-ELISA进行了比较,表明该方法可用于APP血清抗体的检测.上述研究为猪传染性胸膜肺炎血清抗体的检测提供了种特异性方法,为预防、控制乃至根除此病奠定了基础.

目录

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1胸膜肺炎放线杆菌的发现历史

1.2胸膜肺炎放线杆菌的病原学

1.3猪传染性胸膜肺炎的流行病学及其危害

1.4胸膜肺炎放线杆菌的毒力相关因子

1.5猪传染性胸膜肺炎的诊断方法

1.6 ELISA诊断方法的概述

第2章目的和意义

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1菌种与质粒

3.1.2所用血清

3.1.3主要药品及试剂

3.1.4主要培养基

3.1.5引物

3.1.6酶及试剂盒

3.1.7质粒抽提与鉴定试剂

3.1.8 Western-blot相关溶液

3.1.9 ELISA缓冲液

3.1.10试验动物

3.2蛋白的表达及纯化

3.2.1 Apx Ⅱ蛋白的表达与纯化

3.2.2 TbpA蛋白的表达与纯化

3.3 ELISA试验条件的确定

3.3.1最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定)

3.3.2 ELISA的操作步骤

3.3.3 ELISA阴阳界限的确定

3.3.4 ELISA方法的特异性试验

3.3.5 ELISA方法的重复性试验

3.4 ELISA的临床应用与动物试验

3.4.1 Apx Ⅱ-ELISA的临床血清调查

3.4.2 IHA的操作步骤

3.4.3 Apx Ⅱ-ELISA、TbpA-ELISA和IHA间的比较

3.4.4统计分析

3.4.5小鼠免疫及免疫后的检测

3.4.6小鼠免疫及免疫后的检测

第4章结果与分析

4.1 Apx Ⅱ-ELISA诊断方法的研制

4.1.1 Apx Ⅱ表达条件的优化

4.1.2抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择

4.1.3 ELISA结果判定标准的确定

4.1.4 Apx Ⅱ-ELISA特异性和敏感性及重复性试验

4.1.5 Apx Ⅱ-ELISA对APP标准阳性兔血清的检测

4.1.6 Apx Ⅱ-ELISA的临床应用

4.2 tbpA基因的克隆及原核表达

4.2.1 tbpA基因的扩增与克隆

4.2.2阳性重组子序列测定

4.2.3原核表达阳性重组质粒的鉴定

4.2.4 TbpA基因的原核表达及Western blotting检测

4.3 TbpA-ELISA诊断方法的研究

4.3.1抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择

4.3.2 ELISA结果判定标准的确定

4.3.3 TbpA-ELISA特异性与重复性试验

4.3.4 TbpA-ELISA与ApxⅡ-ELISA和IHA间的比较

4.3.5小鼠免疫及免疫后的检测

第5章讨论与结论

5.1讨论

5.1.1 Apx Ⅱ-ELISA诊断方法的研制

5.1.2 TbpA基因的原核表达及其ELISA诊断方法的建立

5.2结论

参考文献

缩略语表

致谢