喹赛多对猪肝胰岛素样生长因子-1和表皮生长因子mRNA表达的影响研究

摘要

喹赛多为喹喔啉类抗菌促生长新药，对猪、牛、鸡等有明显的促生长作用，但目前对其促生长机制还不清楚。该文运用相对定量RT-PCR方法，研究喹赛多对原代培养猪肝细胞以及仔猪肝脏组织中胰岛素样生长因子-1(Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)和表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)mRNA表达的影响，探讨喹赛多抗菌促生长的机理。 猪肝细胞的原代培养采用Seglen建立的两步灌注酶消化法并稍加改进(Seglen，1976)。将分离的猪肝细胞按5×105/孔接种于24孔培养板，每孔加培养液900μL，放入37℃5％二氧化碳培养箱中培养，待细胞80％汇合后，分别加入PBS100μL、生长激素100μL、喹赛多100μL，分成PBS组、生长激素(0.01ng/mL、0.1ng/mL、1.0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)组、喹赛多(50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL)组，继续培养48h，提取细胞总RNA。另取一块24孔培养板，按上述接种方法培养肝细胞48h后，分别按生长激素100ng/mL、喹赛多400ng/mL添加于培养液中，PBS对照组加入等体积的PBS，于4h、8h、12h、24h、48h提取细胞总RNA。将以上总RNA进行反转录PCR。反转录产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用SYNGENE凝胶成像系统分析目的条带的相对灰度值。以上各组均取3孔做细胞计数，观察药物对细胞增殖情况的影响。结果表明，喹赛多按200ng/mL添加于原代培养猪肝细胞中可显著提高其IGF-1mRNA表达(P＜0.05)，而该浓度喹赛多对EGFmRNA表达无显著影响(P＞0.05)；喹赛多400ng/mL、800ng/mL对IGF-1mRNA和EGFmRNA表达均有显著影响(P＜0.05)，但二剂量组间均无显著性差异(P＞0.05)。喹赛多以400ng/mL添加于原代培养的猪肝细胞8h就可显著提高EGFmRNA表达(P＜0.05)，而此时对IGF-1mRNA表达无显著影响(P＞0.05)；12h，24h，48h均可显著提高IGF-1mRNA和EGFmRNA的表达(P＜0.05)。细胞计数的结果表明，喹赛多对肝细胞的增殖无明显影响。 动物试验采用9头去势长大公猪，体重10.0±2.0kg，随机分成3组，每组3头。按美国NRC营养标准(1998)饲养。空白对照组每天饲喂空白料，生长激素对照组每天上午9：00按4mg/d剂量肌注pGH，试验组按200mg/kg饲喂喹赛多，各组均采取自由采食。试验期为10天，最后一天用药4h后屠宰采样，样品立即放液氮速冻后转到-70℃冰箱保存备用，用相对定量RT-PCR分析肝脏中EGF和IGF-1mRNA的表达量。喹赛多以饲料添加剂形式给药仔猪，可显著提高其体增重(P＜0-05)，且可显著提高其肝脏组织中EGF和IGF-1mRNA的表达(P＜0.05)。 结论：喹赛多促生长机理可能是通过提高动物体内IGF-1和EGF等生长因子的转录而发挥作用。该文初步建立了用分子生物学技术来研究喹赛多抗菌促生长作用与动物体内生长相关多肽类生长因子的表达调控之间的关系，为进一步探讨抗菌促生长剂的促生长机理，开发新产品，打下了一定的基础。

目录

论文说明：资助

摘要

缩略语表

1前言

1.1立项依据

1.2目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2离体研究

2.3在体研究

3结果

3.1相对定量RT-PCR方法建立

3.2喹赛多对原代培养猪肝细胞IGF-1、EGF mRNA表达的影响

3.2.1量效关系

3.2.2时效关系

3.3喹赛多对仔猪肝组织中IGF-1、EGF mRNA表达的影响

4讨论

4.1猪肝细胞原代培养方法的改进

4.2相对定量RT-PCR的可靠性分析

4.3喹赛多对原代培养猪肝细胞IGF-1、EGF mRNA表达的影响

4.4喹赛多对仔猪肝组织中IGF-1、EGF mRNA表达的影响

4.5喹赛多促生长机理的探讨

5结论

文献综述

1促生长类药物

2促生长机理

3多肽类生长因子与动物生长

4抗菌促生长新药喹赛多

参考文献

致谢

附录

对各答辩委员的答复书