几种不同鱼类肥胖基因的克隆与鲤肥胖基因的表达研究

摘要

自从人和小鼠的肥胖基因克隆后，肥胖基因一直成为国内外研究的热点。肥胖基因编码的蛋白质(leptin)是反映体内脂肪含量的重要信号因子，leptin主要作用于下丘脑的特异受体，通过下丘脑进行摄食调控和维持能量代谢的平衡，leptin还对机体的免疫应答，繁殖功能，神经内分泌等功能具有重要的作用，具有广泛的生物学效应。现在已经克隆出了人、鼠、猪等动物的肥胖基因，并对其生物功能和表达特点进行了深入的研究。而有关鱼类的ob基因及其功能的研究很少见相关报道。鱼类品种繁多，不同品种的鱼类具有不同的摄食习性，并且鱼类体内脂肪的含量、摄食量以及饱食感与其摄食习性均有较大程度的差异，而对鱼类ob基因的研究将有利于阐明不同品种鱼类的摄食习性与机体的脂肪含量、摄食量以及饱食感之间的关系，对研究鱼类摄食调控的分子机理具有重要意义。本研究试图克隆不同摄食习性鱼类的ob基因，研究该基因在鱼体内和体外的表达特点，为研究鱼类ob基因的功能奠定基础。主要研究工作和结果如下：1.几种不同鱼类肥胖基因的克隆提取不同摄食习性鱼类肠系膜脂肪组织的RNA，包括杂食性鱼类：鲤、鲫；草食性鱼类：草鱼、团头鲂；滤食性鱼类：鳙、鲢；肉食性鱼类：青鱼、乌鳢、大口鲇、鳗鲡、史氏鲟。利用RT-PCR技术从鲤肠系膜脂肪组织中扩增出鲤肥胖基因的cDNA编码序列，将其克隆至pMD18-T载体进行序列测定。测序结果表明，几种不同摄食习性鱼类的ob基因编码区均由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸，几种不同鱼类ob基因之间仅有2-4个核苷酸发生变异，导致1-2个氨基酸发生改变。鱼类ob基因的核苷酸和氨基酸的同源性均达到99％，与Genebank中ob基因序列的同源性进行比较，ob基因具有很强的保守性，鲤ob基因与人、猪、小鼠核苷酸同源性分别为：84％、86％、95％，氨基酸的同源性分别为84％、82％、96％。 2.鲤不同组织和不同胚胎发育阶段ob基因的表达提取鲤不同组织(心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉、脑、脂肪)和不同发育阶段胚胎(卵巢、桑椹期、囊胚、原肠胚、神经胚、肌肉效应期、心跳期、出苗前期、出苗期)的RNA，利用RT-PCR方法对其进行检测,结果表明，鲤ob基因在鲤不同组织中均有表达，在肝脏和脂肪组织中的表达量较高，在其他组织中也有一定的表达；鲤ob基因在未受精卵和不同的胚胎发育阶段均有有表达。由于未进行定量RT-PCR，本研究尚不能确定鲤ob基因在不同的胚胎发育中是否具有发育性变化。人和小鼠的ob基因主要在脂肪组织中表达，在胚胎中也有表达，本研究表明鲤ob基因的表达与人和小鼠相比具有较大的差异。 3.鲤ob基因的表达节律及不同生理条件对ob基因表达的影响本研究由两部分组成。试验Ⅰ：鲤ob基因在不同生理条件下的表达，将40尾鲤按体重随机分成4组，每组10尾，分别设置为正常对照组、饥饿组，饱食组和高脂肪组，14d后采集血清，分别测量血糖、胆固醇、甘油三酯、胰岛素和leptin的浓度。结果表明，高脂肪组血糖浓度高于正常组(P＜0.05)、饥饿组(P＜0.01)和饱食组，饥饿组与正常组和饱食组具有明显的差异(P＜0.01)；胆固醇在不同的试验组中却没有明显的差异；高脂肪组中甘油三酯的浓度高于其他组别，与正常组(P＜0.01)和饥饿组(P＜0.01)相比具有显著差异，与饱食组差异不显著，饥饿组甘油三酯的浓度明显低于正常组和饱食组，并且差异极显著(P＜0.01)；高脂肪组中胰岛素的浓度均高于其他组别，并且差异极显著(P＜0.01)，饥饿组胰岛素浓度低于正常组，差异极显著(P＜0.01)，饱食组与正常组之间没有差异；高脂肪组中leptin浓度均高于其他组别，与正常组和饥饿组比较差异极显著(P＜0.01)，与饱食组差异显著(P＜0.05)，饥饿组leptin浓度低于正常组和饱食组，差异极显著(P＜0.01)，血清leptin浓度与鲤体重(rs=0.817，P＜0.01)、血糖浓度(rs=0.608，P＜0.01)、甘油三酯浓度(rs=0.521，P＜0.01)、胰岛素浓度(rs=0.831，P＜0.01)浓度正相关。 试验Ⅱ：鲤ob基因的昼夜分泌表达规律，将192尾鲤分成2组，分别喂以基础饲料和高脂肪饲料，45天后采集血清，从上午10:00开始，24h之内每隔2小时采集一次，每次8尾，分别测量不同时间鲤ob基因的leptin浓度。结果显示，高脂肪组中鲤血清leptin的浓度明显高于正常组中鲤血清leptin的浓度(P＜0.01)。两组的昼夜节律的低谷均出现在中午12:00左右，高峰出现在午夜至4：00左右，正常组和肥胖组昼夜变化幅度分别为73.5％和33.1％。表明正常组和高脂肪组鲤ob基因均出现一定的昼夜分泌表达规律。 4.鲤ob基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析将鲤ob基因克隆至融合性原核表达载体pET-28a中，构建了鲤ob基因表达载体pET-28a-ob，转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，对表达产物进行提取和纯化，SDS-PAGE检测表明，鲤ob基因在大肠杆菌中实现了融合表达，经凝胶扫描分析，目的蛋白占总蛋白的40％以上。产物的分子量约为20KD，Westernblot分析表明，融合蛋白具有较好的免疫学活性。建立了小鼠肥胖模型。将40只昆明小鼠随机分成两组，分别喂以基础饲料和高脂饲料，45天后分为4组，设为正常对照组、正常注射组、肥胖对照组和肥胖注射组，每组10只，正常注射组和肥胖注射组注射10ug/kg的重组蛋白，对照组注射10ug/kgPBS。记录摄食量和体重变化，7d后采集血清，测量血清中血糖、胆固醇、胰岛素和甘油三酯的浓度。结果表明，重组鲤leptin能够降低正常小鼠和肥胖小鼠的摄食量和体重和体脂量，能够降低肥胖小鼠的血糖、胆固醇、胰岛素和甘油三酯的浓度，能够减少肥胖小鼠的leptin抵抗现象，并且小鼠体脂的含量与血糖(rs=0.46，P＜0.05)、胆固醇(rs=0.78，P＜0.01)、甘油三酯(rs=0.767，P＜0.01)、胰岛素(rs=0.62，P＜0.01)具有明显的正相关性。 5.鲤ob基因在毕赤酵母中的表达将鲤ob基因克隆至含有AOXl启动子和a-factor信号序列的酵母表达载体pPIC9K中，构建了重组表达载体pPIC9K-ob，经过PCR和酶切鉴定正确后，用SalⅠ线性化重组质粒，利用电转化方法转化毕赤酵母感受态细胞，用MD和MM平板进行筛选，提取酵母总DNA，经PCR鉴定证实，目的基因被整合到重组酵母菌染色体中，然后利用G418进行高拷贝筛选，对获得的高拷贝重组酵母菌株进行诱导表达。结果表明，经过G418筛选后得到了3株高拷贝菌株，SDS-PAGE检测，鲤ob基因在毕赤酵母中进行了表达，表达产物分子量约为16KD，Westernblotting分析表明表达产物具有免疫学活性。

目录

文摘

英文文摘

第1章文献综述

1.1肥胖基因的研究进展

1.1.1ob基因的基本结构

1.1.2肥胖基因受体

1.1.3肥胖基因的表达

1.1.4肥胖基因表达的调控

1.1.5 leptin调节的中枢与外周作用

1.1.6 leptin的生物学功能

1.1.7 leptin在肥胖治疗上的应用

第2章几种不同鱼类肥胖基因的克隆

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1肠系膜脂肪组织总RNA的提取

2.3.3重组质粒的酶切鉴定

2.3.4重组质粒的序列测定

2.3.5鱼类肥胖基因的序列分析

2.4讨论

2.5小结

第3章鲤肥胖基因在不同组织和不同胚胎发育阶段的表达

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与分析

3.3.1鲤不同组织中ob基因的表达

3.3.2鲤ob在不同胚胎发育阶段中的表达

3.4讨论

3.5小结

第4章鲤ob基因的表达节律及不同生理条件对ob基因表达的影响

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与分析

4.3.1不同生理条件下鲤leptin的表达

4.3.2鲤leptin的昼夜分泌表达规律

4.4讨论

4.5 小结

第5章鲤肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果与分析

5.3.1重组质粒的酶切鉴定

5.3.2重组质粒的PCR鉴定

5.3.3表达产物的SDS-PAGE检测

5.3.4表达产物的Western blot分析和包涵体的提取

5.3.5小鼠肥胖模型的建立

5.3.6 leptin对小鼠摄食量的影响

5.3.7 leptin对小鼠体重的影响

5.3.8 leptin对小鼠血清相关生化指标和体脂的影响

5.4讨论

5.4.1重组表达载体的构建

5.4.2鲤ob基因表达包涵体的提取与纯化

5.4.3重组鲤leptin的生物学活性

5.5小结

第6章鲤肥胖基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

6.1研究的目的及意义

6.2材料与方法

6.2.1材料

6.2.2方法

6.3结果与分析

6.3.1重组质粒酶切鉴定

6.3.2重组质粒的PCR鉴定

6.3.3重组酵母的转化及鉴定

6.3.5诱导产物的SDS-PAGE电泳及其Western-blot分析

6.4讨论

6.4.1酵母表达重组质粒的构建、表型定

6.4.2高拷贝菌株的筛选

6.4.3酵母的诱导表达

6.5 小结

参考文献

附录1

附录2

致谢