藤茶多糖与总黄酮的提取分离及生物活性研究

摘要

藤茶是一种集营养、保健和药用功效于一体的可直接利用的药食两用野生植物，广泛分布于我国长江流域以南的省份。我国目前对藤茶活性成分的研究集中在藤茶黄酮的提取分离与结构鉴定及部分生物活性方面。天然多糖因其广泛的生物活性而备受关注，植物多糖的来源广泛、应用于生物体的毒副作用小，对植物多糖的研究已成为食品、医药、保健领域的热门课题。目前关于藤茶多糖的研究和藤茶黄酮抗肿瘤活性的研究尚未见报道。 本文以藤茶为原料，首次对藤茶水溶性多糖进行提取、分离与纯化、结构的初步鉴定及生物活性的研究，并对综合提取的藤茶总黄酮进行相关生物活性的评价。 主要研究结果如下： 1藤茶多糖的提取研究和多糖与总黄酮综合提取工艺的探讨 经中心组合试验(CCD)和响应面分析(RSA)，优化出藤茶水溶性多糖提取的主要工艺参数：温度95℃、25：1水料比、提取4h，1次提取多糖得率为4.20％左右(苯酚-硫酸法测多糖含量计)；2次提取率可达97％；醇沉参数为：3倍体积95％EtOH，静置2h；提取2次，多糖得率约为7.4％(粗品称重计)。 初步确定藤茶水溶性多糖与总黄酮综合提取工艺路线为：藤茶粗粉→脱脂脱色→热水浸提→滤液浓缩→分离总黄酮→沉淀多糖→分离粗多糖。提取2次，总黄酮和粗多糖得率分别达到31.0％和6.6％以上(粗品称重计)。 2藤茶多糖的分离纯化与结构的初步鉴定 藤茶水溶性多糖粗品经Sevag法3次处理，得到初步纯化的藤茶多糖AGP，得率约4.5％，AGP蛋白质含量2.0％，多糖含量43.4％。AGP经DEAE-SephadexA-25柱分离出4个级分，其中的AGP-Ⅲ和AGP-Ⅳ组分得率分别约为28.0％和26.0％；再经SephadexG-200柱分离，分别获得相应主要亚级分AGP-3和AGP-4，得率约为67％和69％。AGP-3和AGP-4经SephadexG-200柱和HPLC鉴定，为相对均一多糖。AGP-3和AGP-4均为白色絮状的非淀粉多糖；中性糖含量分别为57.6％和46.2％；糖醛酸含量分别为32.3％和45.7％；蛋白质含量分别为3.5％和4.7％。GPC法测定AGP-3和AGP-4的重均分子量，分别为1.02×105和1.82×105。 气相色谱、红外光谱和核磁共振光谱法分析AGP-3结构，初步确定：AGP-3主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖及己糖醛酸组成，包括β-(1→4)、β-(1→6)、α-(1→6)几种糖苷键类型，并含有蛋白质。AGP-4的气相色谱和红外光谱分析结果与AGP-3相似。 3藤茶多糖的抗氧化活性 经体内体外试验，从不同层次水平系统研究了藤茶多糖的抗氧化活性。AGP与AGP-3在化学模拟体系中具有清除活性氧的能力；体外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠红细胞溶血，抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体MDA的生成和肝线粒体肿胀，剂量-效应关系较明显；相同浓度下，AGP的效果优于AGP-3；体内AGP对小鼠肝组织MDA的生成有显著的抑制效果，但对小鼠血清抗活性氧能力没有明显的提高。 4藤茶多糖的体内抑瘤效果及增强免疫作用 AGP和AGP-3对小鼠体内S180肿瘤具有一定的抑瘤作用。腹腔注射25～100mg/kg·d，9d，AGP和AGP-3的抑瘤率分别为5.81％～32.56％和2.33％～25.58％，呈现一定的剂量-效应关系；相同剂量下AGP-3的抑瘤效果弱于AGP；二者均低于阳性对照Cy的抑瘤率(56.98％)。组织病理学观察，腹腔注射藤茶多糖后的荷瘤小鼠肿瘤组织出现炎性细胞浸润、中性粒细胞致肿瘤细胞崩解、成片状或条状坏死等现象，AGP作用强于AGP-3。 AGP和AGP-3可提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数，增强荷瘤小鼠迟发型超敏反应，增加其脾细胞抗体形成能力和血清溶血素IgM含量，减轻脾脏指数代偿性增大，呈现一定的剂量-效应关系，中高剂量AGP(50、100mg/kg.d)和高剂量AGP-3(100mg/kg.d)效果显著，相同剂量下AGP的效果强于AGP-3。一定剂量的藤茶多糖可通过增强荷瘤小鼠的免疫功能，实现体内抑瘤作用。 AGP和AGP-3可显著抑制荷瘤小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)活性的升高；提高荷瘤小鼠红细胞过氧化氢酶(CAT)活性，中高剂量AGP(50、100mg/kg.d)和高剂量AGP-3(100mg/kg.d)组达到极显著水平。一定剂量的藤茶多糖可以通过抑制LDH活性的升高和促进CAT活性的增强，提高荷瘤小鼠体内的抗氧化能力，达到抑瘤效果。5藤茶多糖对体外人白血病HL-60细胞增殖和细胞凋亡的影响 50～800μg.mL-1范围内的AGP和50～200μg.mL-1范围内的AGP-3对体外培养的HL-60细胞没有明显的抑制作用；相应浓度AGP和AGP-3与小鼠腹腔巨噬细胞(PM)共同培养的上清液，可明显抑制HL-60细胞的增殖，呈剂量-效应关系；AGP-3培养上清(PM-AGP)低于同浓度下AGP培养上清(PM-AGP-3)的作用，二者均明显低于阳性对照VP-16(20μg.mL-1)的效果。 荧光显微镜及电镜观察，PM-AGP与HL-60细胞培养48h，可见到HL-60细胞凋亡的典型特征，存在剂量-效应关系；流式细胞仪分析，PM-AGP(100、200、400、800μg.mL-1AGP)处理48h，HL-60细胞凋亡率分别为4.91％、6.49％、14.34％、22.02％，表现出一定的剂量-效应关系，但低于VP-16的凋亡率(32.57％)，低浓度PM-AGP(100～200μg.mL-1AGP)与对照组间(4.77％)差异不显著。 经TNF-α-ELISA试剂盒测定，AGP可增强LPS激活的小鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子TNF-α的能力，可能是其抑瘤作用的机制之一；免疫组化分析显示，PM-AGP可下调HL-60细胞中抗凋亡基因bcl-2的蛋白表达。 6综合工艺提取的藤茶总黄酮抗氧化、调节血糖和体外抗肿瘤活性 系统研究了藤茶总黄酮(AGTF)的体内外抗氧化活性。铁氰化钾还原体系测定还原力，脂氧合酶-亚油酸体系测定抑制氧化酶的效果。AGTF在化学模拟体系中具有清除活性氧的能力；2.0mg.mL-1对脂氧合酶活性的抑制率达到50％以上；体外可提高小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠红细胞溶血，抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体MDA的生成和肝线粒体肿胀，剂量-效应关系较明显。 腹腔注射AGTF(50、100mg/kg.d)12d，使四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值显著降低，下降率为20.06％和26.61％，并可显著升高糖尿病小鼠血清抗活性氧单位和降低小鼠肝匀浆MDA含量。 终浓度25～400μg.mL-1的AGTF对体外培养48h的HL-60细胞增殖抑制率为7.5％～56.9％；流式细胞仪分析，50～400μg.mL-1AGTF处理48h的HL-60细胞凋亡率为4.02％～44.96％。 综合工艺提取的藤茶总黄酮(AGTF)具有较强的抗氧化、调节血糖和体外抗肿瘤活性，工艺可行。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

第一章前言

1藤茶的研究进展

1.1藤茶概述

1.2藤茶化学成分的研究

1.3藤茶药理作用与生物活性的研究

2课题构想

2.1课题研究目的意义

2.2课题研究的主要内容

参考文献

第二章藤茶水溶性多糖与总黄酮提取工艺的研究

引言

1材料与方法

2结果与分析

2.1提取单因素对水溶性多糖得率的影响

2.2中心组合试验结果与响应面分析

2.3乙醇用量及沉淀时间对粗多糖得率的影响

2.4总黄酮与粗多糖综合提取工艺路线的确定

3讨论

参考文献

第三章藤茶多糖的分离纯化与结构的初步鉴定

引言

1材料与方法

2结果与分析

2.1藤茶多糖粗品的脱蛋白效果

2.2 AGP的DEAE-Sephadex A-25柱层析

2.3 AGP-Ⅲ和AGP-Ⅳ的Sephadex G-200柱层析

2.4藤茶多糖分级组分的纯度鉴定

2.5藤茶多糖与纯化组分的理化分析

2.6藤茶多糖结构的初步分析

3讨论

参考文献

第四章藤茶多糖的抗氧化活性

引言

1材料与方法

2结果与分析

2.1藤茶多糖的还原能力

2.2藤茶多糖在化学模拟体系中的抗活性氧能力

2.3藤茶多糖对小鼠血清体外抗活性氧能力的影响

2.4藤茶多糖对H202诱导的小鼠红细胞(RBC)溶血的影响

2.5藤茶多糖对体外小鼠肝组织匀浆MDA生成的影响

2.6藤茶多糖对体外小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响

2.7藤茶粗多糖对小鼠体内血清活性氧及肝组织MDA的影响

3讨论

参考文献

第五章藤茶多糖体内抗肿瘤与增强免疫活性研究

引言

1材料与方法

2结果与分析

2.1藤茶多糖体内抑瘤作用

2.2肿瘤组织病理学观察

2.3藤茶多糖对荷瘤小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响

2.4藤茶多糖对荷瘤小鼠红细胞过氧化氢酶(CAT)活力的影响

2.5藤茶多糖对荷瘤小鼠内脏指数的影响

2.6藤茶多糖对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

2.7藤茶多糖对荷瘤小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响

2.8藤茶多糖对荷瘤小鼠脾细胞抗体形成的影响

2.9藤茶多糖对荷瘤小鼠血清溶血素含量的影响

3结论

4讨论

参考文献

第六章藤茶多糖对人白血病HL-60细胞凋亡的影响

引言

1材料与方法

2结果与分析

2.1藤茶多糖及多糖-巨噬细胞培养上清对HL-60细胞生长曲线的影响

2.2藤茶多糖及多糖-巨噬细胞培养上清对HL-60细胞增殖的抑制作用

2.3藤茶多糖对小鼠巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响

2.4形态学观察结果

2.5 HL-60细胞凋亡的DNA梯带

2.6藤茶多糖与小鼠巨噬细胞培养上清诱导HL-60细胞凋亡的流式细胞仪分析

2.7藤茶多糖与巨噬细胞培养上清对HL-60细胞中bcl-2基因表达的影响

3讨论

参考文献

第七章藤茶总黄酮的生物活性研究

引言

第一节藤茶总黄酮的抗氧化作用

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节藤茶总黄酮对四氧嘧啶诱导型糖尿病小鼠的降血糖作用

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节藤茶总黄酮的抗肿瘤活性

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第八章结论

第九章文献综述：植物多糖的生物活性研究进展

引言

1植物多糖的提取分离与纯化

2植物多糖的结构分析

3植物多糖的生物活性

3.1植物多糖的免疫调节作用

3.2植物多糖的抗肿瘤活性

3.3植物多糖的抗氧化活性

3.4植物多糖的降血糖活性

3.5植物多糖的降血脂活性

3.6物多糖糖的抗病毒活性

3.7植物多糖的其它生物活性

参考文献

致谢

附录 攻读学位期间发表论文