菹草类胡萝卜素的结构鉴定、分类及生物活性研究

摘要

菹草(Potamogeton crispus L.)是一种多年生沉水维管束植物，分布十分广泛。广大湖区的蛋鸭采食菹草后能产下优质的红心鸭蛋。已有研究表明，蛋黄色泽与饲料中类胡萝卜素的种类和含量密切相关。本研究室研究结果揭示，菹草中含有大量的类胡萝卜素，它不仅能加深蛋黄色泽，同时关于它的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生物活性更是成为当今研究的热点之一。菹草作为一种新的类胡萝卜素资源，无论是其类胡萝卜素的结构分类研究、还是生物活性的系统探讨以及资源的深度开发利用均鲜见报道，因此深入研究菹草中类胡萝卜素将对菹草资源的开发利用具有重要的战略意义。 本课题综合运用了色谱及波谱等现代仪器手段和化学分析方法，对菹草中类胡萝卜素的结构进行了分类研究，同时采用生物学前沿技术和手段，探讨了菹草类胡萝卜素的抗氧化活性及体内外抗肿瘤的作用与机制。研究结果如下： 1.菹草类胡萝卜素的结构鉴定与分类 采用有机溶剂石油醚：丙酮(1：1，v/v)提取菹草中类胡萝卜素，通过完全皂化处理得到菹草总类胡萝卜素TCPC。采用柱层析和薄层层析对TCPC进行分离纯化，得到组分y<,1>，y<,2>，y<,3>和y<,4>。为鉴定菹草类胡萝卜素y<,1>、y<,2>、y<,3>和y<,4>的化学结构，本文系统运用了色谱、波谱技术，结合化学分类反应，鉴定y<,1>，y<,2>，y<,3>和y<,4>分别为新黄质、紫黄质、叶黄素和β-胡萝卜素(菹草中红色素已由本实验室上届博士生鉴定为紫杉紫素的顺反异构体)。菹草中含有胡萝卜素和叶黄素两大类类胡萝卜素，主要为新黄质、紫黄质、叶黄素、紫杉紫素和β-胡萝卜素等五种类胡萝卜素。 本文采用分光光度法测定了菹草中类胡萝卜素总含量(以干基计算)为230.8μg/g。用HPLC法测定了菹草中各种类胡萝卜素的相对含量(以干基计算)：菹草中β-胡萝卜素的含量为80.2μg/g；新黄质的含量为2.4μg/g：紫黄质的含量为24.8μg/g；叶黄素的含量为84.4μg/g；紫杉紫素的含量为36.0μg/g。 2.菹草类胡萝卜素的生物活性 本文研究了菹草总类胡萝卜素TCPC和菹草紫杉紫素RPC的体外抗氧化能力，并从免疫学和细胞凋亡角度对菹草类胡萝卜素的抗癌活性进行了研究，探讨了类胡萝卜素抗癌的作用机理。 (1)菹草类胡萝卜素体外抗氧化活性研究本实验通过对羟自由基、红细胞溶血、肝脏与肝线粒体中的脂质过氧化以及肝线粒体肿胀度的测定，结果发现菹草总类胡萝卜素TCPC能够有效地清除羟自由基，抑制由羟自由基引起的脂质过氧化，保护生物膜，减少红细胞溶血，减轻肝线粒体肿胀程度，提示TCPC具有很强的抗氧化能力。 通过对TCPC和RPC在油脂中的抗氧化作用研究，结果发现在油脂自动氧化实验中单独使用RPC无抗氧化作用，而使用TCPC具有抗氧化作用。TCPC和RPC对VC的抗油脂氧化性能均有一定的协同增效作用，且TCPC的增效作用比RPC强。油脂光敏氧化实验结果表明，TCPC和RPC均可抑制由亚甲基蓝所引发的油脂光敏氧化，且抑制效果随着类胡萝卜素浓度的升高而增强。 (2)TCPC对H<,22>荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究以肝癌H<,22>荷瘤小鼠为模型，分别灌胃5mg/kg.d、10mg/kg.d和20mg/kg.d TCPC10d后均可显著抑制肿瘤的生长，其抑瘤率分别为37.4％，50.7％，52.3％；TCPC各剂量组均能显著提高荷瘤小鼠迟发型超敏反应的强度，促进T淋巴细胞增殖和NK细胞活性；增强肝脏中SOD的活性，降低MDA的含量；TCPC还可诱导小鼠肝癌细胞发生凋亡，将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期。结果提示TCPC抗肿瘤的作用机理可能涉及到对机体免疫功能的调节、抗氧化作用以及诱导癌细胞发生凋亡，改变细胞周期等方面。 (3)TCPC和RPC诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究首次提出TCPC 和RPC诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡是类胡萝卜素抗肿瘤活性的作用机制之一。其凋亡机制可能与改变细胞周期、降低线粒体跨膜电位、增加胞内钙离子浓度、增强iNOS活性，升高NO浓度等方面有关。MTT实验发现2.5～10μg/mL TCPC和5～20μg/mL RPC对Hela细胞的生长有显著的抑制作用，且具有时间-效应和剂量-效应关系。采用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜和激光扫描共聚焦显微镜观察到。TCPC和RPC作用4d后的Hela细胞呈典型的凋亡形态。与对照组比较，流式细胞仪检测到TCPC和RPC作用Hela细胞后使其细胞周期发生改变，线粒体跨膜电位降低。激光扫描共聚焦显微镜检测经TCPC和RPC处理4d后的细胞胞内Ca<'2+>浓度显著升高。TCPC和RPC还可使HeLa细胞培养液中NO含量显著增加，NOS及iNOS活性显著增强，细胞膜中唾液酸含量明显降低。经国内外文献检索表明：以上有关菹草中类胡萝卜素的结构鉴定与分类、菹草总类胡萝卜素TCPC和菹草紫杉紫素RPC的抗氧化活性及抗肿瘤活性的研究均未见报道。

目录

论文说明：缩略语表

声明

摘要

第一章前言

1本课题的研究背景

1.1菹草与红心鸭蛋蛋黄色泽的关系

1.2类胡萝卜素的生物活性

2本课题的研究意义

3本课题的研究内容

3.1菹草类胡萝卜素的结构鉴定与分类

3.2菹草类胡萝卜素的生物活性研究

第二章菹草类胡萝卜素的结构鉴定与分类

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要化学试剂

1.3实验仪器及设备

1.4实验方法

2结果与分析

2.1菹草类胡萝卜素的结构鉴定与分类

2.2菹草类胡萝卜素的含量测定

3讨论

3.1菹草类胡萝卜素的提取、分离纯化

3.2菹草类胡萝卜素的结构鉴定与分类

3.3菹草类胡萝卜素的含量测定

第三章菹草类胡萝卜素的生物活性

第一节菹草类胡萝卜素的体外抗氧化活性研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节菹草类胡萝卜素对小鼠肝癌H22的抑制作用

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节菹草类胡萝卜素对人宫颈癌HELA细胞株的生长抑制与凋亡的影响

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第四章结论

第五章文献综述：类胡萝卜素的生物活性研究进展

1抗氧化作用

1.1类胡萝卜素对单线态氧的清除作用

1.2类胡萝卜素对自由基的捕捉

1.3类胡萝卜素的抗氧化作用研究现状

2抗癌作用

2.1流行病学研究

2.2体外细胞培养研究

2.3动物实验研究

2.4类胡萝卜素抗癌机理的研究

3增强免疫功能

4类胡萝卜素的其它功能

参考文献

致谢

附录