棉花植株再生和农杆菌介导的Enhancer trap遗传转化

摘要

本文通过建立高效棉花遗传转化体系，采用农杆菌介导的转基因方法，旨在创建棉花T-DNA插入的Enhancer-trap突变系。主要研究结果如下： 1.为了提高棉花遗传转化效率，针对转化过程中的一些重要影响因素，如菌株、AS、菌液浓度、共培养时间等做了一系列分析实验。实验结果显示：农杆菌浓度0.50D值左右是比较理想的浓度；MGL菌液培养基中加入50mg/L乙酰丁香酮；共培养温度19℃，暗培养48小时，能够获得较高的转化效率；不同菌株对棉花品种转化效率不相同，菌株LBA4404较C58C3更加适合于以下胚轴为外植体的棉花遗传转化。 2.在愈伤继代过程中设置不同的2、4-D和Kinetin浓度组合，发现随着2、4-D浓度的降低，愈伤块发绿、变硬、不利于愈伤分化成胚性愈伤。 3.通过体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化方法，获得了转基因棉花YZ1植株。通过PCR检测和Southern杂交及组织化学染色(GUS染色)证实了已成功将目的基因片断转入到棉花基因组中并成功表达。 4.报告基因(gus gene)在抗性愈伤、胚性愈伤、幼胚和再生植株根部均能表达，经组织化学染色，在愈伤组织中GUS基因表达频率达到49.3％。

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论文说明：缩略词表

声明

1文献综述

1.1棉花的组织培养

1.1.1组织培养技术的发展

1.1.2棉花的组织培养和植株再生

1.1.3影响体细胞胚发生和植株再生的因素

1.2植物遗传转化方法

1.2.1基因枪法

1.2.2花粉管通道法

1.2.3根癌农杆菌介导法

1.2.4 PEG法

1.2.5显微注射法(micro-injection)

1.2.6电激法

1.2.7碳化硅纤维介导转化法

1.2.8其它方法

1.3植物突变体库创建与功能基因组研究

1.3.1植物突变体库的创建

1.4 Gene trap技术在植物功能基因组研究中的应用

2方法和材料

2.1供试材料

2.1.1植物材料

2.1.2根癌农杆菌和转化载体

2.1.3培养条件及其不同培养基配方

2.2实验方法

2.2.1转化方法

2.2.2再生苗的嫁接和移栽

2.2.3转化材料的分子鉴定

2.3转化体系中的参数调节

2.3.1乙酰丁香酮对转化效率的影响

2.3.2不同菌株转化效率的影响

2.3.3农杆菌浓度对转化效率的影响

2.3.4不同共培养温度对转化效率的影响

2.3.5不同共培养时间对转化效率的影响

2.3.6不同品种转化效率比较

3结果与分析

3.1转化体系参数优化

3.1.1乙酰丁香酮对转化效率的影响

3.1.2不同的农杆菌菌株对转化的影响

3.1.3不同浓度的农杆菌对愈伤组织侵染的影响

3.1.4共培养温度对农杆菌侵染力的影响

3.1.5共培养时间对抗性愈伤组织率的影响

3.1.6不同品种转化效率比较

3.2抗性愈伤继代过程中激素调节

3.3农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化体系的建立

3.4转基因棉花植株的分子检测

3.4.1 PCR检测

3.4.2转基因再生植株的Southern杂交分析

3.5 GUS基因在转基因植株再生过程中的表达

4讨论

4.1棉花遗传转化中的品种选择和改良

4.2农杆菌介导的遗传传化中外植体的选择

4.3农杆菌转化棉花下胚轴的参数优化

4.4 Enhancer trap和promoter trap在棉花中的表达频率的比较

参考文献

致谢