斑马鱼Z-OTU蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达

摘要

斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物发育生物学和遗传学研究的重要模式动物,其卵子发生及早期胚胎发育过程的调控机制已经引起越来越多研究者们的高度重视。最近的研究表明,泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)参与了哺乳动物卵子发生和早期胚胎发育过程的许多重要事件,如卵母细胞生发泡破裂、第一极体的排放、MⅡ阻滞的维持和克服等。UPP途径是真核生物细胞内一种高效的蛋白质降解途径,能够参与体内许多重要的生物学功能,包括细胞周期、胚胎发育、生长控制、凋亡、神经元退化等,其表达异常可以引发许多疾病。去泛素化酶(Deubiqitinating enzymes,DUBs)是UPP的重要组分,具有调控UPP的重要作用。目前,在斑马鱼中还未见任何有关DUB的报道。
　　 我们研究的斑马鱼otu基因(简称Z-otu,下同)编码的蛋白可能具有DUBs活性,它具有一个典型的otu保守框,属于otu-like半胱氨酸蛋白酶家族的成员。Z-otu不仅是一个斑马鱼卵巢特异表达的基因,而且还是一个卵子发生早期和胚胎发育早期特异表达的基因。在早期卵母细胞(卵原细胞或刚分化的卵母细胞、Ⅰ-Ⅲ期卵母细胞)中,Z-otu mRNA有表达且表达量呈现出递减的趋势；在Ⅳ期卵母细胞和成熟的卵子(V期卵母细胞)中几乎检测不到该基因的表达；Z-otu mRNA在合子期到囊胚早期胚胎的胚盘细胞中表达,而在囊胚晚期之后直到5dpf(不包括5dpf)的胚胎中检测不到表达。生物信息学分析结果显示Z-OTU是一个核蛋白,其491-514氨基酸区域存在一个长24个氨基酸的跨膜区域,预测结果还显示该蛋白的N端位于膜外,没有明显的信号肽区域,表明其是一个非分泌蛋白。
　　 为了进一步分析Z-OTU蛋白的功能,本文设计了特异性引物并采用PCR扩增了该基因的otu保守域(简称otu1),将该片段插入pGEX-6p-1载体后,与GST标签蛋白融合后转化到大肠杆菌BL21中。构建好的融合表达质粒经PCR、酶切检测和测序鉴定后,用IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,得到一个与预期目的蛋白分子量(42kDa)相符的条带。将原核表达的融合蛋白纯化后免疫新西兰兔,获得多克隆抗体anti-Z-OTU,并利用该抗体对斑马鱼卵巢和胚胎进行免疫组织化学检测。
　　 斑马鱼卵巢免疫组化检测结果显示,在卵母细胞初级生长期(Ⅰ期),Z-OTU蛋白定位于生发泡(GV)内,而在细胞质中未检测到该蛋白的表达；在stageⅡ期和stageⅢ期的卵母细胞中,Z-OTU蛋白开始向细胞质迁移,主要分布在生发泡周围、细胞质中和细胞膜上,在卵黄和皮层小泡中几乎检测不到该蛋白的表达；在stageⅣ期卵母细胞中,Z-OTU蛋白主要集中在生发泡的近植物端,在随后的发育中伴随着生发泡一起向未来的动物极迁移。整体荧光免疫组织化学检测结果显示Z-OTU蛋白的分布在斑马鱼胚胎发育早期随发育阶段的不同而发生变化:卵母细胞受精后,Z-OTU蛋白位于细胞质中,并伴随着胞质流动；随着胚胎的进一步发育,Z-OTU均匀的分布在卵裂后的各个细胞中,但是在中囊胚转换之后,Z-OTU蛋白主要分布在体节形成的部位。在斑马鱼胚胎发育早期,Z-OTU蛋白的表达量也随发育阶段的不同而发生变化:Z-OTU蛋白在30％外包期的表达量明显低于在1000细胞期的表达量；当胚胎发育到体节期时,Z-OTU蛋白的表达量继续降低,到13体节后已检测不到Z-OTU蛋白。上述结果表明,Z-OTU蛋白在斑马鱼卵子发生、受精和胚胎发育早期可能有着非常重要的生物学功能。
　　 根据本研究及以前的研究,我们分析并比较了Z-otu基因的mRNA和蛋白的分布,结果表明二者的时空表达有一定差异:mRNA仅在卵子发生早期表达,卵母细胞受精后才重新开始表达,而其蛋白在卵子发生过程中均表达；在卵子发生过程中,mRNA分布于细胞质中,而蛋白质先分布于细胞核中,然后向细胞质迁移,接着又向GV集中。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 斑马鱼的特性、配子发生及胚胎发育

1.1.1 斑马鱼的生物学特性

1.1.2 斑马鱼的配子发生

1.1.3 斑马鱼的受精作用

1.1.4 斑马鱼的胚胎发育

1.2 去泛素化酶(DUBs)的研究进展

1.2.1 DUBs是UPP的重要组分

1.2.2 DUBs的分类

1.2.3 DUBs的生物学功能及研究中存在的问题

1.3 otu基因的研究现状

1.3.1 otu-related蛋白酶家族的研究进展

1.3.2 果蝇otu基因的研究现状

1.3.3 Z-otu基因的研究进展

2.本研究的目的意义

3.材料和方法

3.1 试验材料

3.1.1 实验动物的来源和饲养

3.1.2 菌株

3.1.3 工具酶、试剂盒和主要试剂

3.1.4 主要溶液

3.1.5 细菌培养基

3.1.6 Inoue法制备超级感受态细胞所需溶液

3.1.7 小量碱法提取质粒DNA所需试剂

3.1.8 主要仪器设备

3.2 试验方法

3.2.1 试验技术路线

3.2.2 表达载体的构建

3.2.3 重组蛋白GST-OTU1引物设计和PCR扩增

3.2.4 PCR产物纯化

3.2.5 Inoue法制备超级感受态细胞

3.2.6 目的片段及表达载体的双酶切处理

3.2.7 连接反应

3.2.8 转化

3.2.9 重组质粒检测

3.2.10诱导蛋白表达

3.2.11表达蛋白SDS-PAGE电泳

3.2.12表达蛋白的纯化

3.2.13多克隆抗体anti-Z-OTU的制备

3.2.14双向琼脂扩散实验检测抗体的效价

3.2.15卵巢组织免疫组织化学

3.2.16胚胎整体荧光免疫组织化学

4.结果

4.1 重组表达载体的构建

4.1.1 PCR扩增目的片段

4.1.2 pGEX-6p-1载体质粒检测

4.1.3 重组质粒的检测

4.2 融合蛋白诱导表达及融合蛋白的提取

4.2.1 融合蛋白的诱导表达结果

4.2.2 融合蛋白的提取

4.3 双向免疫扩散试验

4.4 免疫组化染色

4.4.1 Z-OTU蛋白在卵子发生过程中的表达模式

4.4.2 Z-OTU蛋白在胚胎发育早期的表达

5.讨论

5.1 表达片段的确定

5.2 表达引物的设计

5.3 双酶切

5.4 诱导条件的优化

5.5 抗原的制备

5.6 抗体效价的检测

5.7 Z-OTU 蛋白在斑马鱼发育过程中的作用

5.7.1 Z-OTU蛋白在斑马鱼卵子发生中的作用

5.7.2 Z-OTU蛋白在斑马鱼胚胎早期发育中的作用

6.小结

6.1 本研究获得的结果及创新点

6.2 本研究的不足之处和下一步值得研究的工作

参考文献

致谢