农杆菌介导法培育无标记基因的Bt抗虫中花11和光温敏不育系N5088S

摘要

虫害是造成水稻减产的主要原因之一。研究结果显示，在水稻及其近源种中缺乏对螟虫（二化螟、三化螟等）的有效抗性资源；因此，难以通过常规育种方法培育抗虫品种而达到控制虫害之目的。长期以来人们普遍采用化学杀虫剂来控制害虫。然而，由于钻蛀害虫在植株表面停留的时间很短，因此化学杀虫剂很难对其起到很好的防治作用。 利用转基因技术培育具有抗虫性状的品种是一种新的控制害虫的有效方法。转Bt基因的作物在农业上的使用可以大幅度的减少杀虫剂的使用量，这不仅直接降低了种植者的种植成本，而且对保护人类的健康和生态环境都有积极的意义。 近几年来，随着环境释放和商品化生产的转基因作物数量不断增加，转基因作物的安全性问题日益受到人们的重视，其可能导致的潜在食品和环境安全风险成为人们关注与争论的焦点。这些问题的焦点之一在于对选择标记基因的担忧。排除这种担心的一个有效的办法是培育无选择标记基因的转基因作物。 本研究以优良的粳稻品种中花11和光温敏核不育系N5088S为受体材料，利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记的转cry1C*基因的水稻植株。与非转基因对照植株相比，转cry1C*基因的水稻植株具有非常好的抗螟虫效果。其主要结果如下： 1、利用人工合成的、密码子优化后的cry1C*抗虫基因，构建了无选择标记基因的抗虫基因高效表达载体pC130。将此载体电转化到农杆菌EHA105后，与农杆菌EHA105/PCAMBLA1300以3：1的浓度比进行共转化。共获得N5088S T0代抗性植株865棵及中花11T0代抗性植株178棵。 2、通过目的基因cry1C*基因的PCR阳性检测，得到N5088S T0代cry1C*阳性植株99棵，中花11 T0代cry1C*阳性植株20棵。 3、通过田间初步观察，筛选出农艺性状无太大改变的N5088S及中花11 T0代阳性植株共40株。Southern杂交检测得到13个单拷贝植株。 4、对筛选出来的T1代家系进行PCR检测，得到受体材料来源为中花11，无标记基因的单株L252—21。 5、对单株L252—21进行发芽试验和Southern杂交检测，进一步证实其为无选择标记转基因植株。 6、通过ELISA的检测方法对筛选出来的4个重点crylC*基因为单拷贝的转基因家系进行了蛋白含量的测定，结果表明LN22-21家系的蛋白表达量为0.82±0.35μg/g鲜组织重，LN24-9家系Bt蛋白的表达量为0．90±0．12μg/g鲜组织重，L252-21家系的蛋白表达量为0．78±0.36μg/g鲜组织重，LZ62-4家系的蛋白表达量为0．32±0．23μg/g鲜组织重。 7、在筛选出来的3个重点cry1C*基因为单拷贝转基因家系中分别选一株农艺性状无太大改变的T1代单株，和LN52-21无标记植株一起，分别收获种子并带到海南繁殖。 8、对海南T2代转基因植株进行hph基因以及crylC*基因的PCR检测，选出hph为阴性而crylC*为阳性的植株，并同时对其农艺性状进行初步筛选。4个家系分别筛选出田间抗虫性增强且无标记的转基因植株19株，21株，14株和24株。 9、对4个重点家系进行农艺性状的田间初步考察，与原品种相比，不同转基因家系中均存在一定程度的变异。还需要进一步回交恢复。

目录

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英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1文献综述

1.1苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白的结构与功能研究

1.1.1BT杀虫晶体蛋白及其基因的分类

1.1.2BT杀虫晶体蛋白的三维结构与功能

1.1.3BT杀虫晶体蛋白的作用过程与杀虫机理

1.2转BT基因植物的商品化现状

1.2.1转BT基因植物商品化现状

1.2.2中国的转BT作物的种植状况

1.2.3转BT水稻商品化的可能性和存在的问题

1.3培育安全性选择标记或无标记转基因植物的策略

1.3.1选用安全的标记基因

1.3.2培育无选择标记基因植株

1.4研究目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1受体植物材料

2.1.2菌株、质粒、及外源片段

2.2实验方法

2.2.1无标记基因植物表达载体构建

2.2.2农杆菌介导的N5088S及中花11的遗传转化

2.2.3T0代转基因植株的cry1C*基因PCR阳性检测

2.2.4转基因植株的Southern blot检测及拷贝数鉴定

2.2.5T1代转基因植株的种植和cry1C*及hph基因的阳性检测

2.2.6无标记转基因单株hph基因删除检验

2.2.7T2代转基因植株的种植和cry1C*基因及hph基因的阳性检测

2.2.8无选择标记转基因阳性植株的Bt蛋白含量测定

2.2.9重点转基因植株的农艺性状调查分析

3结果与分析

3.1农杆菌介导的遗传转化

3.2T0代转化植株的cry1C*基因的PCR阳性检测

3.3转基因植株的Southernblot检测及拷贝数鉴定

3.4.T1代转基因植株的种植和cry1C*基因及hph基因的阳性检测

3.5抗虫中花11水稻LZ52-21和LZ52-13植株hph基因剔除检验

3.6部分T2代转基因植株的种植和cry1C*基因及hph基因的阳性检测

3.7部分单拷贝植株Bt蛋白含量检测

3.8目标转基因植株的初步田间抗虫性观察

3.9重点转基因植株的考种分析

4讨论

4.1水稻共转化方法应用的初步探讨

4.2转基因植株农艺性状的改变及其克服途径

4.3拷贝数在共转化系统中的重要性

4.4Bt毒蛋白抗虫基因工程的潜在问题、解决途径及展望

4.5几种剔除选择标记转化系统的比较

参考文献

附录

致谢