胸膜肺炎放线杆菌JL03株的全基因组测序与flp操纵子的结构分析

摘要

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的传染性呼吸道疾病。该病分布广泛,遍布世界各地,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。APP血清型众多,目前已经发现有15种血清型,各个国家和地区有不同的流行血清型,我国主要流行1、2、3和7型。由于不同血清型之间的交叉保护力较低,给对该病的预防控制带来了极大的困难。传统的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗只能对同源血清型菌株感染产生保护力,而不能对异源血清型菌株的感染提供保护,因此全菌灭活疫苗和亚单位疫苗的适用范围有限,不能被广泛应用。但自然感染或试验感染能够诱导抗异源血清型菌株的感染,因此弱毒活疫苗也许是弥补当前疫苗缺点的一种可行方法。要开发合理有效的弱毒活疫苗需要对APP的整个遗传背景有充分的了解,同时需要在APP中进一步寻找和研究潜在的毒力因子。
　　1.胸膜肺炎放线杆菌JL03株基因组测序及初步拼接目前全基因组测序技术已经成熟,在此时开展对APP的全基因组测序能对APP的基础及应用研究产生广泛的影响。由于血清3型APP菌株是我国的流行血清型,因此测序菌株选取从国内临床分离的血清3型菌株JL03。这为研究我国流行菌株的致病发病机理及PCP的预防控制提供基本资料。通过测序和初步的拼接,所测序列被拼接成186个重叠群,总有效测序碱基18,471,205 bp,达到8.03倍基因组覆盖率,为进一步填补基因组空缺及对基因组进行生物信息学分析奠定了基础。
　　2.胸膜肺炎放线杆菌flp操纵子的结构分析及序列比较在伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)和杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)中,flp操纵子与细菌的黏附和毒力相关。同时伴放线放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌同为巴氏杆菌科中的病原菌。基于这个背景,对APP中的flp操纵子的结构和功能展开了相关研究。通过对APP标准1型4074株flp操纵子的分析,在APP中flp操纵子有15个基因,并包含有完整的启动子和终止子。通过对APP标准1型菌株4074,标准5型菌株L20和临床分离血清3型菌株JL03的flp操纵子序列进行比较分析,发现JL03株flp操纵子5′端有约3.7kb的缺失,并且缺失包含flp操纵子的启动子区域。RT-PCR实验结果显示JL03菌株flp操纵子不能转录,而4074株flp操纵子可以转录。对实验室保存的所有标准血清型1-15(不含14型)和临床分离3型菌株HB0504,LZ-03和GDSB的PCR实验结果显示这些菌株的flp操纵子不包含有类似JL03菌株的缺失。透射电镜实验结果显示,具有完整flp操纵子的4074株能产生Flp菌毛,而不具有完整flp操纵子的JL03株不能产生Flp菌毛。
　　3.胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074株tadA基因缺失突变株构建目前对APP的Flp菌毛是否与APP的毒力相关还不清楚。因此本研究以能产生菌毛的4074株为亲本菌,使用同源重组技术缺失flp操纵子中的重要功能基因tadA。构建了重组自杀载体pBⅡSK(+)LRscm和pEMOC2LR,并以这两个质粒分别构建了标准1型4074株的单交换重组菌株TadAS1和TadAS2,为进一步筛选tadA基因缺失菌株及对flp操纵子的功能研究奠定了基础。

目录

摘要

Abstract

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1.1 猪传染性胸膜肺炎的概述

1.1.1 病原学

1.1.2 流行病学

1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的诊断

1.1.4 猪传染性胸膜肺炎的防制

1.2 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究进展

1.2.1 外毒素

1.2.2 荚膜

1.2.3 脂多糖

1.2.4 外膜蛋白

1.2.5 转铁结合蛋白

1.2.6 脲酶

1.2.7 蛋白酶

1.2.8 黏附因子

1.3 病原菌基因功能研究方法进展

1.3.1 自然突变

1.3.2 化学诱变技术

1.3.3 转座子突变

1.3.4 同源重组

1.3.5 STM

1.3.6 SCOTS

1.3.7 DFI

1.3.8 IVET

1.3.9 IVIAT

第2章 胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03株全基因组测序与初步拼接

2.1 研究目的及意义

2.2 实验材料

2.2.1 菌株

2.2.2 寡核甘酸引物

2.2.3 培养基

2.2.4 主要试剂

2.3 实验方法

2.3.1 细菌的增殖

2.3.2 琼脂糖扩散实验

2.3.3 细菌基因组提取及测序文库构建

2.3.4 文库测序

2.3.5 序列初步拼接

2.4 结果与分析

2.4.1 测序用基因组鉴定

2.4.2 文库构建、质量评估及大规模测序

2.4.3 序列初步拼接

2.5 讨论

2.6 结论

第3章 胸膜肺炎放线杆菌flp操纵子的结构分析

3.1 研究目的及意义

3.2 实验材料

3.2.1 菌株

3.2.2 寡核甘酸引物

3.2.3 培养基

3.2.4 主要试剂

3.3 实验方法

3.3.1 细菌的增殖

3.3.2 细菌PCR模板制备

3.3.3 PCR扩增

3.3.4 flp操纵子结构分析

3.3.5 细菌RNA提取

3.3.6 反转录PCR

3.3.7 透射电镜实验

3.4 结果与分析

3.4.1 flp操纵子结构分析及序列比较

3.4.2 flp操纵子完整性的验证(DNA和RNA水平)

3.4.3 胸膜肺炎放线杆菌Flp菌毛检测

3.5 讨论

3.6 结论

第4章 胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074株tadA缺失突变体构建

4.1 研究目的及意义

4.2 实验材料

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 寡核甘酸引物

4.2.3 培养基

4.2.4 主要试剂

4.3 实验方法

4.3.1 细菌的增殖

4.3.2 细菌PCR模板制备

4.3.3 PCR扩增

4.3.4 限制性酶切

4.3.5 从凝胶中回收目的片段

4.3.6 DNA片断的连接

4.3.7 感受态的制备及转化

4.3.8 碱裂解法小量制备质粒DNA

4.3.9 胸膜肺炎放线杆菌电转感受态细胞的制备及转化

4.3.10 接合转移与胸膜肺炎放线杆菌缺失株的构建

4.4 结果与分析

4.4.1 重组自杀质粒pBIISK(+)LRscm构建

4.4.2 重组自杀质粒pBIISK(+)LRscm电转化APP及缺失菌株筛选

4.4.3 重组自杀质粒pEMOC2LR构建

4.4.4 重组自杀质粒pEMOC2LR电转化APP及缺失菌株筛选

4.4.5 结合转移转化pEMOC2LR进入APP及缺失菌株筛选

4.5 讨论

4.6 结论

参考文献

致谢

附录