猪链球菌2型及其毒力相关因子对细胞的吸附和毒性作用的研究

摘要

猪链球菌(Streptocuccus suis,S.suis)是一种重要的病原菌,在全世界范围内广泛存在,并造成了巨大的影响。根据荚膜多糖抗原成分不同,可以将猪链球菌分为35个血清型(1-34型和1/2型)。其中,猪链球菌2型(Streptocuccus suistype2,SS2)是最常见、也是毒力最强的血清型。目前,对猪链球菌在动物体内的传播机制还缺乏足够的了解,其毒力相关因子在致病性中扮演的具体角色也依然不甚清楚,相关研究主要集中在猪链球菌2型致猪脑膜炎的机理上。深入了解猪链球菌的致病机理,可以为链球菌病的预防和治疗提供科学的依据。病原菌与宿主细胞之间的相互作用,是致病过程中发挥着重要的作用的一环。对其的研究可以促进对致病机理的探索,并可以为药物筛选、疫苗设计提理论依据,以便制定科学的疫病控制措施。本试验以Hep-2细胞系为模型,以8种不同表型的猪链球菌2型菌株1,6,9,21,A3,A38,A40,SC19为试验对象,克隆表达并制备纯化MRPA,SLY,IMPDH,HSP60,HSP705种毒力相关因子,以Hep-2细胞为细胞模型,进行猪链球菌的吸附试验,侵入试验和链球菌的细胞毒性试验,然后用纯化的蛋白单独或与猪链球菌共同作用进行蛋白细胞毒性试验以及吸附抑制试验等一系列试验,试图从细胞水平上揭示猪链球菌感染的特点,以及毒性相关蛋白在链球菌感染中的可能发挥的作用。试验结果表明:在猪链球菌吸附试验中,8株猪链球菌菌株中SC19,A40,21三株可明显吸附于Hep-2细胞,p<0.01,但是菌株6和A3几乎不能吸附。在猪链球菌侵入试验中,绝大多数猪链球菌菌株都不能侵入Hep-2细胞。吸附抑制试验的结果表明,蛋白SLY,MRPA,IMPDH,HSP60,HSP70均能够抑制猪链球菌对Hep-2细胞的吸附,差异有极显著意义(p<0.001)。从猪链球菌细胞毒性试验的结果得出,除菌株1外,所有的其余7个菌株都对Hep-2细胞产生强烈的毒性作用,与对照组相比,差异有显著性,p<0.05,并且这种毒性作用随着细菌的数量的减少有逐渐减弱的趋势。但是菌株6、A3、A40、SC19在细菌数为10~5时,毒性达到一个小的峰值。蛋白SLY,MRPA,IMPDH,HSP60,HSP70均能够对Hep-2细胞产生一定的毒性作用,与对照组相比,差异性有显著性(p<0.05),但是,浓度变化与其毒性效果差异无显著意义(p>0.05)。结论:EF、SLY、MRP这三种重要的毒力相关因子在猪链球菌2型的吸附过程中都不是必需的。猪链球菌2型可以吸附但是不能侵入Hep-2细胞。猪链球菌2型对细胞有明显的毒性。蛋白SLY,MRPA,IMPDH,HSP60,HSP70均能够对Hep-2细胞产生一定的毒性作用并且抑制猪链球菌2型对细胞的吸附。

目录

摘要

ABSTRACT

缩略语表(按字母顺序排列)

第一章 文献综述

1.1 猪链球菌病

1.1.1 前言

1.1.2 病原学

1.1.3 流行病学

1.1.4 毒力(相关)因子

1.1.5 致病机理

第二章 猪链球菌2型及其毒力相关因子和细胞的相互作用的研究

2.1 研究目的和研究意义

2.2 材料

2.2.1 主要试剂

2.2.2 菌株

2.2.3 细胞

2.2.4 菌种

2.2.5 培养基

2.2.6 pET-28a表达载体

2.2.7 细胞消化液

2.2.8 实验所用缓冲液

2.2.9 引物

2.3 方法

2.3.1 细菌的培养

2.3.2 SS2基因组DNA的制备

2.3.3 药敏试验

2.3.4 PCR方法鉴定

2.3.5 PCR扩增

2.3.6 PCR产物的纯化

2.3.7 连接反应

2.3.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.3.9 连接产物的转化

2.3.10 质粒DNA的小量制备(碱裂解法)

2.3.11 质粒的大量制备(碱裂解法)

2.3.12 重组载体的鉴定

2.3.13 原核表达

2.3.14 SDS-PAGE电泳

2.3.15 融合蛋白的纯化

2.3.16 链球菌细胞毒性试验

2.3.17 侵入试验

2.3.18 吸附试验

2.3.19 蛋白毒性试验

2.3.20 吸附抑制试验

2.3.21 统计处理

2.4 结果

2.4.1 PCR与药敏试验

2.4.2 SLY，MRPA，IMPDH的PCR扩增

2.4.3 重组载体的酶切鉴定

2.4.4 链球菌细胞毒性试验

2.4.5 链球菌侵入试验

2.4.6 链球菌吸附试验

2.4.7 链球菌吸附抑制试验

2.4.8 蛋白毒性试验

2.5 讨论

2.5.1 SS2及猪链球菌病

2.5.2 猪链球菌与宿主相互作用研究

2.5.3 SLY与猪链球菌致病性的关系

2.5.4 MRP与猪链球菌致病性的关系

2.5.5 IMPDH与猪链球菌致病性的关系

2.5.6 链球菌的吸附试验

2.5.7 猪链球菌的侵入试验

2.5.8 猪链球菌吸附抑制试验

2.5.9 猪链球菌细胞毒性试验

2.5.10 蛋白毒性试验

2.6 结论

参考文献

致谢