禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究

摘要

禽流感(AI)与新城疫(ND)是世界公认的最重要的两大禽类传染病，可导致禽类的大量死亡或生产性能的急剧下降，给世界养禽业造成巨大的经济损失，同时由于禽流感病毒(AIV)可以感染人，引起人发病甚至死亡，给人类的公共卫生安全造成了极大的威胁。目前，对于AI和ND的诊断主要有病毒分离、血凝和血凝抑制、ELISA、RT-PCR等，但由于耗时冗长或需要特殊的仪器设备及技术人员，难以满足现场、适时快速诊断的要求。 胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体，通过毛细管作用原理，以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法。这种方法具有操作简单、快捷，分析结果清楚、易于判断，且不需要任何仪器、成本低廉等优点，非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此，在医学快速检测领域得到了迅猛发展，目前已逐渐应用于动物医学领域的快速检测。 本研究针对目前禽类呼吸道疾病病原检测方法中存在的问题，运用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心法原理，建立了两种禽类主要呼吸道病原的快速检测技术，取得了如下研究成果。 1.鸡抗AIV、鸡抗NDV和山羊抗鼠多克隆抗体的制备及纯化 用通过鸡胚传代，经超离浓缩后的AIV(H9N2)和NDV免疫健康鸡，同时，以纯化的小鼠IgG免疫山羊，制备了鸡抗AIV、鸡抗NDV、羊抗鼠高免血清。对所得高免血清分别采用饱和硫酸铵粗提和G-200过柱纯化，最后得到了纯化的鸡抗AIV、鸡抗NDV和羊抗鼠抗体。 2.单克隆抗体的制备与纯化 利用纯化的AIV融合表达蛋白GST-NP和NDV免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞，经过细胞融合、筛选和多次克隆分别获得5株针对AIV-NP，5株针对NDV-HN的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。同时对实验室制备和保存的禽流感H55E8和H94C4单克隆细胞株成功进行了复苏。经小鼠腹腔接种获得的单抗效价均较高，5株针对AIV-NP的ELISA效价均在1:3.2×104以上；5株针对NDV-HN的ELISA效价均在1:1.6×104以上，HI效价均在1:210以上；禽流感H55E8和H94C4的腹水HI效价分别为1:214和1:216。对其中效价高的几株进行了纯化，获得了高纯度的单克隆抗体。 3.胶体金及金标抗体的制备 采用柠檬酸三钠还原法，成功确立了20nm胶体金的制备条件；并利用制备好的胶体金，对前述制备的抗禽流感核蛋白单克隆抗体(AIV-NP5F4)、抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体(H94C4)、抗禽流感H5亚型血凝素单克隆抗体(H55E8)、抗新城疫病毒血凝素神经氨酸酶单克隆抗体(NDV-HN213)进行了胶体金标记条件的摸索，成功确立了单克隆抗体的胶体金标记条件：最适pH值为8.0，最适标记量为12μg/mL胶体金，并制备了相应的金标抗体。 4.H5、H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制 以胶体金标记禽流感H5、H9亚型血凝素单克隆抗体作为示踪物，用固定在检测线上的鸡抗AIVIgG作为捕获抗体，采用双抗体夹心法，分别成功地建立了H5、H9亚型AIV免疫层析快速检测试纸条。用制成的H9亚型AIV试纸条检测已知H9N2亚型AIV尿囊液和禽流感H9亚型标准血凝抗原时，检测线出现明显的紫红色条带，而阴性对照、其它AIV标准血凝抗原以及多种禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV，IBDV等均呈阴性反应；用制成的H5亚型AIV试纸条检测已知禽流感H5亚型标准血凝抗原时，检测线出现明显的紫红色条带，而阴性对照、其它AIV标准血凝抗原以及多种禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV，IBDV等均呈阴性反应。效价测定的结果表明，H9亚型AIV检测试纸条的灵敏度可以达到0.25个血凝单位，比血凝试验高4倍以上，H5亚型AIV检测试纸条的灵敏度与HA试验相当。在此基础上，本研究用金标记抗禽流感病毒核蛋白单克隆抗体作为示踪物，在两条检测线上分别包被禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体H94C4、禽流感H5亚型血凝素单克隆抗体H55E8作为捕获抗体，建立了H5、H9亚型AIV快速鉴别诊断试纸条。实验结果证明，本方法特异性强，灵敏度高，且操作简便、结果判定直观，可以用于H5、H9亚型AIV的快速检测及鉴别诊断。 5.禽流感和新城疫病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制 本研究以胶体金标记抗AIV-NP单克隆抗体作为示踪物，用固定在检测线上的鸡抗AIVIgG作为捕获抗体，采用双抗体夹心法，成功地建立了AIV胶体金快速检测试纸条。用制成的试纸条检测已知H5、H7、H9亚型禽流感病毒标准血凝抗原时，检测线出现明显的紫红色条带，而阴性对照、其它禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV，IBDV等均呈阴性反应；效价测定的结果表明，试纸条法的灵敏度比血凝试验高4倍以上。以胶体金标记抗NDV-HN单克隆抗体作为示踪物，用固定在检测线上的鸡抗NDVIgG捕获抗体，采用双抗体夹心法，成功地建立了NDV胶体金快速检测试纸条。用制成的试纸条检测已知NDV时，检测线出现明显的紫红色条带，而阴性对照，H5、H7、H9亚型禽流感病毒标准血凝抗原以及其它禽类病毒包括EDS-76V、IBV、ILTV，IBDV等均呈阴性反应；效价测定的结果表明，试纸条法的灵敏度比血凝实验至少高4倍。在此基础上，采用一膜包被多个抗体的方法，用混合后的金标记抗AIV-NP单克隆抗体和胶体金标记抗NDV-HN单克隆抗体作为示踪物，建立了AIV和NDV快速鉴别诊断试纸条。实验结果证明，本方法特异性强，灵敏度高，且操作简便、结果判定直观，可以用于AIV和NDV的检测与鉴别诊断。 6.禽流感病毒通用型及H9亚型快速检测试剂盒的研制与应用 用建立的快速检测方法成功研制出禽流感病毒快速检测试剂盒和H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒。分别对两种试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性及保存期的测定。结果表明，在4℃能保存12个月，室温能保存6个月而特异性和敏感性没有任何变化，而且特异性强、敏感性高、重复性好，操作简单、方便，能快速、准确地检测出样品中是否带有禽流感病毒或H9亚型禽流感病毒抗原。对试剂盒的验证结果表明，两种试剂盒均能在感染三天之内检出禽流感病毒，真正达到了早期检测的要求。临床采集311份样品，用H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒及禽流感病毒快速检测试剂盒进行检测，检出率分别为35％和39.2％，与本室早期研制的禽流感病原ELISA诊断试剂盒的符合率分别为92％和100％，对试剂盒检测样品的病毒分离鉴定证明无一漏检。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词(Abbreviation)

声明

第1章文献综述

1禽流感研究进展

1.1病原

1.2流行病学

1.3禽流感检测方法研究进展

2新城疫研究进展

2.1新城疫病毒(NDV)

2.2新城疫的传播与危害

2.3新城疫检测方法

3.胶体金免疫层析技术

3.1胶体金的特性及其制备

3.1.1胶体金的特性

3.1.2胶体金的制备

3.2免疫胶体金的制备及其应用

3.2.1免疫胶体金的制备

3.2.2免疫胶体金的应用

3.3胶体金免疫层析试纸条的构成

3.4胶体金免疫层析技术的原理及其优势

3.4.1胶体金免疫层析技术的原理

3.4.2胶体金免疫层析技术的优势

3.5胶体金免疫层析技术的应用

3.5.1病原体抗原或抗体的检测

3.5.2激素或疾病相关蛋白的检测

3.5.3药物残留及毒品的检测

3.5.4寄生虫抗原抗体的检测

第2章鸡抗AIV、鸡抗NDV和山羊抗鼠多克隆抗体的制备及纯化

1研究目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1病毒的增殖与纯化(浓缩)

3.2免疫血清IGG的提取及纯化

4讨论

4.1抗原

4.2免疫程序

5结论

第3章单克隆抗体的制备与纯化

1研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1细胞融合

3.2杂交瘤细胞的筛选

3.3单克隆抗体效价测定及特异性鉴定

3.4单克隆抗体的亚类鉴定

3.5杂交瘤细胞染色体数的检测

3.6禽流感H55E8、H94C4单克隆细胞株的复苏、生产与效价测定

3.7单克隆抗体的纯化

4讨论

4.1动物免疫

4.2细胞融合

4.3杂交瘤细胞的筛选

4.4杂交瘤细胞的克隆

4.5关于饲养细胞

4.6杂交瘤细胞的冻存和复苏

4.7单克隆抗体的纯化

5结论

第4章胶体金及金标抗体的制备

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1胶体金的制备

3.2禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体(H94C4)的标记条件

3.3单克隆抗体H55E8、AIV-NP单克隆抗体及NDV血凝素神经氨酸酶单克隆抗体的标记条件

3.4金标单抗复合物的鉴定

4讨 论

4.1胶体金的制备

4.2标记用蛋白的准备

4.3胶体金的标记

4.4免疫胶体金的保存

5结论

第5章H5、H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1 H9亚型AIV免疫层析快速检测试纸条的研制

3.2 H5亚型AIV免疫层析快速检测试纸条的研制

3.3 H5、H9亚型AIV鉴别诊断试纸条的研制

4讨论

4.1最适反应条件的确定

4.2关于鉴别诊断

5结论

第6章禽流感和新城疫病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1各种生物材料最佳浓度的选择

3.2试纸条的特异性实验

3.3试纸条的敏感性实验

4讨论

4.1金标结合垫的制备

4.2鉴别诊断试纸条的构建

5结论

第7章禽流感病毒通用型及H9亚型快速检测试剂盒的研制与应用

1研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1试剂盒的特异性和敏感性试验

3.2试剂盒的保存期试验

3.3试剂盒的重复性试验

3.4试剂盒的样品检测结果

4讨论

4.1试剂盒的特性

4.2关于亚型鉴定

4.3检测样品范围

5结论

参考文献

研究生期间发表的主要论文

致谢