微囊藻毒素-LR对草鱼和斑马鱼免疫基因表达及草鱼免疫器官超微结构的影响

摘要

微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育、行为和生长，也可引起肝脏、肾脏等内部器官的病理变化和鱼体生理生化指标的变化。然而，有关微囊藻毒素对鱼类免疫系统毒性的研究则几乎是空白。本研究以草鱼和斑马鱼为对象，采用电镜、荧光定量PCR和基因芯片技术在细胞和分子水平上揭示了MC-LR对鱼类免疫系统的影响。 通过腹腔注射微囊藻毒素-LR(MC-LR；纯度>98％，50μg/kg体重)，发现MC-LR不仅引起草鱼肝脏病变，而且还引起免疫器官的病变。MC-LR对肝细胞的早期毒性表现为细胞间连接间隙增宽，肝细胞中出现胆汁淤积，其线粒体和内质网也受到损伤，但到注射MC-LR21天后草鱼肝细胞超微结构基本正常。在脾脏和头肾中受损的细胞主要是淋巴细胞。MC-IR可引起草鱼脾脏淋巴细胞的凋亡，在注射MC-IR2天后，观察到大量细胞出现凋亡；7天后，凋亡细胞减少，到21天大部分细胞与对照组没有差异；MC-LR可引起草鱼头肾淋巴细胞线粒体、内质网损伤，到21天则观察不到这样的病理变化。 用荧光定量PCR检测了草鱼在注射MC-LR(纯度>98％，50μg/kg体重)1、2、4、7、14和21天后，白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、I型干扰素(IFNI)、免疫球蛋白M(IgM)、主要组织相容性复合体I(MHC-I)、长链肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)等六个免疫基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达。发现IL-1β在头肾中的表达受到抑制，在所有的取样时间内与对照组均有显著差异(P<0.05)。肝脏、脾脏和头肾中TNF-α、IFNI和PGRP-L的表达同样受到了显著抑制(P<0.05)；肝脏中IgM和MHC-I的表达则受到显著抑制(P<0.05)。这说明MC-LR可抑制草鱼的免疫功能。 经腹腔注射MC-LR(纯度>95％，400μg/kg体重)12、48、96小时后，取斑马鱼肝脏，利用三个时间段的混合样品和对照组分别与Affymetrix公司斑马鱼基因芯片进行杂交，筛选差异表达的基因。该基因芯片包括14900个转录本，处理组斑马鱼的基因表达与对照组的比值大于等于2或小于等于0.5时，认为该基因表达上调或下调。经两次芯片重复实验发现有273个基因(10.13％)出现了表达水平的变化，表达上调的基因数为243个，下调的仅为30个。根据基因的功能注释进行分类，上调的基因主要包括细胞骨架结构类、细胞外基质成分、凋亡基因、肿瘤因子、应激因子、信号转导因子、细胞循环因子、生长因子、运输因子、转录因子、代谢相关基因和免疫因子；下调的基因主要包括免疫相关的基因。进行基因本体论(GeneOntology)分析发现MC-LR主要引起细胞循环(Cellcycle)和丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPKsignalpathway)的变化，通路分析结果表明MC-LR可能引起了斑马鱼肿瘤的发生，而大量免疫基因表达的下调则表明MC-LR可能抑制了斑马鱼的免疫功能，这也与在草鱼中观察到的结果一致。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章微囊藻毒素及其对鱼类的毒理学影响：综述

1微囊藻毒素的产生、分布及其毒性机理

1.1水体富营养化的形成及影响

1.2微囊藻毒素的产生

1.3微囊藻毒素的化学结构和理化性质

1.4微囊藻毒素在天然水体中的含量及分布

1.5微囊藻毒素的检测方法

1.6微囊藻毒素的毒性机理

2微囊藻毒素对鱼类的毒理学影响

2.1微囊藻毒素在组织中的积累

2.2微囊藻毒素对胚胎孵化的影响

2.3微囊藻毒素对鱼类行为和生长的影响

2.4微囊藻毒素对鱼类心律的影响

2.5微囊藻毒素对血清生化指标的影响

2.6微囊藻毒素对氧化酶和解毒酶活性的影响

2.7微囊藻毒素引起的鱼类组织病理

2.8微囊藻毒素的遗传毒性

2.9微囊藻毒素的免疫毒性

3本研究的目的

第二章微囊藻毒素-LR对草鱼脾脏、头肾和肝脏超微结构的影响

1前言

2材料与方法

2.1供试材料

2.2实验鱼的处理

2.3电镜样品的制备

2.4 DNA凝胶电泳

3结果

3.1脾脏

3.2头肾

3.3肝脏

3.4 DNA片段化

4讨论

第三章微囊藻毒素-LR对草鱼免疫相关基因表达的影响

1前言

2材料与方法

2.1实验鱼的处理

2.2 RNA的提取

2.3 RNA样品中DNA的去除

2.4 cDNA模板的准备

2.5标准曲线的建立

2.6荧光定量PCR

2.7统计分析方法

3结果

3.1 RNA质量的检测

3.2反转录效果的检测

3.3基因的非特异性检测

3.4标准曲线的绘制

3.5微囊藻毒素-LR对草鱼六个免疫相关基因表达的影响

4讨论

4.1白介素-1β

4.2肿瘤坏死因子-α

4.3 I型干扰素

4.4长链肽聚糖识别蛋白

4.5免疫球蛋白M

4.6主要组织相容性复合体I

第四章利用基因芯片技术对微囊藻毒素-LR处理斑马鱼后肝脏基因表达谱的研究

1前言

2材料与方法

2.1斑马鱼的处理

2.2 RNA的提取

2.3样品RNA的荧光标记

2.4斑马鱼靶标杂交

2.5斑马鱼阵列的清洗、染色和扫描

2.6数据分析

2.7 Pathway分析

2.8荧光定量PCR验证实验

3结果

3.1 RNA质量检测结果

3.2差异表达基因分析

3.4 Pathway分析结果

3.5荧光定量PCR的验证结果

4讨论

全文小结

参考文献

附录 攻读博士学位期间论文发表情况

致谢