利用酵母双杂交系统筛选与猪Calsarcin-1基因相互作用的蛋白

摘要

Calsarcin(calcineurin-associatedsarcomericprotein)基因家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin)结合的肌肉特异蛋白质新家族，已发现的CaIsarcin基因家族成员有Calsarcin-1、Calsarcin-2和Calsarcin-3。其中，Calsarcin-1基因在心肌和骨骼肌慢肌纤维中特异表达，Calsarcin-2和Calsarcin-3只在骨骼肌的快肌纤维中特异表达。研究证实，Calsarcin-1基因敲除小鼠的肌肉过度生长，Calcineurin活性升高，表明Calsarcin-1抑制Calcineurin的活性。因此，Calsarcin-1基因可能通过与Calcineurin结合调节Calcineurin的活性，共同参与肌细胞内由Ca2+调控的信息传递功能，从而调控其它相关基因的表达，在肌纤维的分化和发育过程中发挥重要的作用。 另外，Calsarcin-1与a-actinin、γ-filamin、telethonin等多种结构蛋白质共定位于Z-disc。因此，推测Calsarcin-1对Z-disc结构的形成和稳定起重要作用。 为了更好的认识Calsarcin-1基因及其互作蛋白对肌细胞钙离子的调控作用，了解快慢肌纤维的决定和分化的分子机理，本研究采用酵母双杂交筛选技术对Calsarcin-1相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。主要研究成果如下： 1.从pEGFP-N1-CS1荧光表达载体中分离得到Calsarcin-1的编码区，并构建到pGBKT7诱饵表达载体中，获得了能成功表达且无毒性的pGBKT7-CS1诱饵表达载体。 2.成功地分离、纯化了猪肌肉组织的双链cDNA，用来表达猎物文库的融合蛋白。 3.将诱饵载体、双链cDNA及猎物载体pGADT7-Rec共转化到感受态的酵母细胞中，进行酵母双杂交筛选，初步筛选到与Calsarcin-1相互作用的29个阳性克隆。 4.经PCR筛选、酶切、测序和结果分析，获得到3个感兴趣的蛋白(CASQ1、TNNT3和ACTN3)。其中CASQ1和TNNT3参与了肌细胞中对钙离子的调控，ACTN3则参与了维持Z线结构稳定。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

第一章前言

1.1 Calsarcins基因家族的研究概述

1.2猪骨骼肌肌纤维分化的调控机制

1.2.1肌纤维的组成和分类

1.2.2骨骼肌纤维类型对猪肉品质的影响

1.2.3钙调神经磷酸酶信号途径与骨骼肌纤维类型形成的关系

1.2.4 Calsarcins基因家族在肌纤维类型形成中的作用

1.3酵母双杂交系统

1.3.1酵母双杂交的原理

1.3.2酵母双杂交系统的应用

1.3.3酵母双杂交系统的优缺点

1.4本课题的主要目的和技术路线

第二章诱饵载体pGBKT7-CS1的构建及验证

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2常用试剂及试剂盒

2.1.3常用试剂及培养基的配制

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1目的片段Calsarcins-1的制备

2.2.2诱饵载体的制备

2.2.3诱饵菌株转录活性及毒性的检测

2.3结果与分析

2.3.1 Calsarcin-1基因CDS区的扩增

2.3.2重组质粒的酶切

2.3.3 pGBKT7载体酶切

2.3.4诱饵载体酶切

2.3.5酵母菌株AH109的表型验证

2.3.6 DNA-BD融合蛋白毒性及转录活性的检测分析

2.4小结与讨论

第三章猪肌肉双链cDNA的制备

3.1材料

3.1.1猪的组织样品

3.1.2常用试剂及试剂盒

3.2方法

3.2.1猪肌肉总RNA的提取与检测

3.2.2猪肌肉mRNA的分离

3.2.3肌肉文库双链cDNA的合成

3.3结果与分析

3.3.1猪肌肉组织总RNA电泳结果

3.3.2猪肌肉组织mRNA电泳结果

3.3.3双链cDNA的纯化结果

3.4小结与讨论

第四章酵母双杂交筛选与Calsarcin-1互作的基因

4.1材料

4.1.1菌株、质粒与载体

4.1.2主要试剂盒

4.1.3培养基及配置

4.2方法

4.2.1用共转化方法筛选与Calsarcin-1互作的基因

4.2.2对照菌株的小量转化

4.2.3阳性克隆的筛选与鉴定

4.3结果与分析

4.3.1共转化结果

4.3.2菌落PCR鉴定结果

4.3.3 AD质粒酶切鉴定结果

4.4阳性克隆测序及序列比对结果

4.5小结与讨论

第五章小结

5.1本实验获得的结果

5.2本实验的创新性

5.3本研究的不足之处

5.4下一步工作计划

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表文章情况