农杆菌介导的红曲菌M-7转化库中部分突变子的特性研究

摘要

本研究以农杆菌介导的红曲菌转化库中的8132株转化子为材料，通过菌落形态观察结合显微特征分析，筛选获得一批形态特征变化显著的转化子，并将其分为七类。在此基础上，对转化子的主要代谢产物进行了分析，为从基因水平上阐述红曲菌代谢产物的合成调控机理提供了材料。主要研究结果如下。 1.农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的扩建 参照实验室以前建立的农杆菌介导法转化红色红曲菌(Monascusruber)M-7的条件：出发菌株M-7在麦芽汁培养基上30℃培养20d，红曲菌孢子浓度为105个/mL，农杆菌的浓度OD600为0.5，诱导剂AS浓度为80mmol/L，农杆菌与红曲孢子混合液于30℃共培养3d，将转化库从5132转化子扩增至8132个转化子。 2.转化子筛选及形态观察 将8132个转化子分别接种在PDA培养基上，30℃培养15d。通过菌落形态观察，获得230株在菌落颜色、生长速度和气生菌丝等方面都与出发菌株M-7有明显差异的转化子，并将其分为七类：(1)菌落直较径大，菌落呈年轮状分布；(2)菌落直径较大，菌落颜色较浅，气生菌丝呈从卷毛状；(3)菌落直径较大，菌落颜色较浅，气生菌丝呈流苏状；(4)菌落直径较大，菌落颜色较深，气生菌丝呈从卷毛状；(5)菌落直径较小，菌落平坦，气生菌丝呈从卷毛状；(6)菌落直径较小，菌落中部隆起，气生菌丝较短；(7)菌落直径中等，菌落有扇形分化。从每一类中再挑选一些具有代表性的菌株进行显微形态观察，结果显示，转化子在分生孢子形状、菌丝表面附着物、闭囊壳的数量和形态上也发生较大变化。 3.部分转化子的PCR鉴定及稳定性研究 从上述230株将转化子中挑选35株接种于不含潮霉素的PDA培养基上，25℃培养7d，连续转接5代后，再转接到含有50μg/mL，潮霉素的PDA平板上，以出发菌株M-7作为对照，观察菌落在抗性培养基上的生长状况并计数。从35株转化子中挑选14株代表菌株，提取基因组并进行PCR鉴定(根据T-DNA上的gus基因设计引物)。结果显示上述14株转化子经过5轮培养后，仍能在含50μg/mL潮霉素的PDA平板上生长，抗性稳定性达88.57％，并且14株转化子的基因组中均有T-DNA插入。 4.部分转化子蛋白酶和淀粉酶活的分析 采用DNS法、Folin法等方法测定了上述14株转化子固态发酵产物--红曲的淀粉酶活、蛋白酶活，并结合淀粉聚丙烯酰胺凝胶电泳(Starch-PAGE)的方法比较不同转化子淀粉酶组份和活性差异。 结果如下：有13株转化子红曲的淀粉酶活高于M-7的淀粉酶活160.45U/g，其中1067＃约为M-7的20倍，达3227.10U/g；大部分的供试菌株蛋白酶均高于M-7，其中878＃的酸性蛋白酶活最高，达1543U/g，约为M-7的2倍；1067＃的中性蛋白酶活最高，达3211U/g，约为M-7的4倍；2225＃的碱性蛋白酶活最高，达1773U/g，约为M-7的4倍。采用Starch-PAGE能够有效的检测淀粉酶活性组分，结果显示活性组分越多，淀粉酶活力越高。 5.部分转化子次生代谢产物的分析 采用UV-VIS、TLC、HPLC、ELISA等方法测定了14株转化子红曲的色价、MonacolinK、γ-氨基丁酸和桔霉素的含量。结果表明，与出发菌株相比，突变株产次级代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。14株转化子的红曲色价值均低于出发菌株M-7的色价4350u/g，其中806＃和2553＃的色价分别为180u/g和328u/g，不到M-7的1/10；10株突菌株红曲的MonacolinK含量高于M-7，其中3245＃的MonacolinK含量约为M-7的10倍，分别为679.25μg/g和69.75μg/g；GABA含量方面，以178＃制备的红曲GABA含量最高，达1.455g/Kg，约为M-7的3倍；由1822＃制备的红曲的桔霉素含量最高，为60.01ng/g，而806＃与178＃制备的红曲的桔霉素含量在实验条件下未检测到。

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论文说明：缩略语表

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第一章文献综述

1红曲与红曲菌

1.1红曲

1.2红曲菌

2红曲菌的主要代谢产物

2.1酶类活性物质

2.2红曲色素

2.3莫呐可啉K(Monacolin K)

2.4γ-氨基丁酸(GABA)

2.5红曲中的桔霉素

2.6其他活性物质

3红曲菌遗传转化研究

4本研究的目的及意义

第二章转化库的扩增、筛选及其遗传稳定性分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1转化库的扩增

2.2转化子的筛选

2.3转化子的形态观察及分类

2.4转化子的稳定性分析

2.5转化子的PCR鉴定

3讨论

3.1农杆菌介导的红曲菌转化

3.2T-DNA的插入对红曲菌形态的影响

第三章转化子的蛋白酶活和淀粉酶活的分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1转化子淀粉酶活的测定

2.2淀粉酶性质研究

2.3转化子蛋白酶活的测定

2.4蛋白酶性质研究

3讨论

第四章转化子的次级代谢产物分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1色价的测定与紫外扫描分析

2.2 Monacolin K的测定分析

2.3 GABA的测定分析

2.4桔霉素的测定分析

3讨论

结论与讨论

1结论

2讨论

参考文献

致谢

附 录读研期间发表的论文