柑橘高效遗传转化体系的建立与类胡萝卜素代谢相关基因的遗传转化

摘要

柑橘是世界上最重要的水果之一，果实品质一直是柑橘育种追求的主要目标。长期以来，童期长、珠心胚、性器官败育以及遗传上的高度杂合等因素一直严重影响着柑橘育种工作的开展。基因工程的发展为柑橘的育种工作开辟了一条新的途径，从而使利用单个基因改造柑橘的品质成为可能。本研究利用章期较短的早实枳作为转化材料，建立并优化了其高效再生和遗传转化的体系，以期使其成为柑橘基因功能验证和研究的平台。利用该转化体系和RNA干涉技术，获得了一批与柑橘类胡萝卜素代谢相关基因的遗传转化材料，并对这些材料进行了分子鉴定和基因表达的初步分析，本研究主要取得了以下结果：
　　 1.建立了早实枳（Poncirus trifoliata[L.]Raf.）和Cocktail葡萄柚（C. paradisi Macf.×C. reticulata Blanco.）的高效再生及遗传转化体系，对若干影响再生和转化效率的因素，如外植体的绿化、共培养条件，激素的组合和用量，筛选的方法等进行了优化。对黄化的早实枳茎段或Cocktail上胚轴进行4-5 d的光照处理，可以显著提高外植体的再生能力和转化率；共培养过程中，0.4.mg L-1的2,4-D可显著提高外植体的转化率，而过高的2,4-D浓度（0.6-0.8 mg L-1）则抑制不定芽的再生，降低转化率。培养基G（MT+1 mg L-1 BA+0.1 mg L-1 NAA）对正常芽的再生最有利，过高的BA浓度（大于1.5 mg L-1）虽然能提高芽的数量，但也造成大量畸形芽的出现。实验中还发现，潮霉素对早实枳茎段的再生有强烈的抑制作用。在早实枳再生试验中，通过嫁接再生的早实枳有36.4％（8/22）只需要9个月就能开花，而通过生根再生的植株在第12个月时有32％（8/25）的植株开花，第20个月时，这些再生植株有87.2％（41/47）开花。这表明早实枳早花早果的特性可以经过组织培养和再生过程稳定地遗传给后代，可以用于柑橘功能基因的研究。
　　 2.构建了BCH基因片段的反义表达载体pCABCH，并用于转化伏令夏橙（C。sinensis Osb.cV.Valencia）的胚性愈伤组织，得到了6个独立的转化株系，并测定了抗性愈伤组织中类胡萝卜素含量的变化，结果表明，大部分转化愈伤中叶黄素和α-胡萝卜素的含量有所增加。50-60 mg L-1的潮霉素对伏令夏橙愈伤组织的再生影响较大，强烈抑制再生植株的生长。
　　 3.构建了CRTISO基因片段的反义表达载体pBICI，分别转化了早实枳和山金柑，得到了23株早实枳再生植株，其中12株PCR检测呈阳性；得到转化山金柑4株。
　　 4.分别以LCYB的基因序列片段，和LCYE基因的5’和3’端片段，构建了pLCYB，pLCYE1和pLCYE2的RNAi表达载体，并用于转化早实枳和Cocktail葡萄柚。Real-time PCR结果表明，在LCYE基因被抑制的的早实枳植株中，PDS基因的表达量显著增加，LCYB和ZEP基因的表达量下降。HPLC分析表明，发生LCYE基因抑制的植株叶片中，α-胡萝卜素含量的下降，β-胡萝卜素的含量和紫黄质的含量增加，而叶黄素的含量没有显著的变化。但β-胡萝卜素和紫黄质的含量却与其基因的表达水平呈反比1据此我们推测，对LCYE基因的干涉可能通过某种机制激活了上游PDS基因的活性。而β-胡萝卜素和紫黄质的含量增加可能与代谢物质的反馈调节有关：随着PDS基因表达量增加，上游ζ-类胡萝卜素和番茄红素的含量增加，导致下游的代谢产物β-胡萝卜素和紫黄质的含量显著增加，而这些代谢产物对其本身的合成基因LCYB和ZEP又产生了反馈抑制作用。
　　 在抑制LCYB表达的早实枳植株中，PSY，ZDS，CRTISO和ZEP基因的表达量呈下降趋势。同时，β-胡萝卜素和下游紫黄质的含量在转基因植株叶片中的含量下降，α-胡萝卜素和叶黄素的含量没有显著的变化。β-胡萝卜素的含量和LCYB基因的表达量呈正相关，即LCYB基因的表达量越高，叶片中β-胡萝卜素的含量也越高。而这一过程可能会导致番茄红素的积累。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述

1.1柑橘遗传育种研究进展

1.1.1柑橘遗传育种的目标和成果

1.1.2育种手段

1.2柑橘生物技术研究概况

1.2.1组织培养技术

1.2.2原生质体培养及融合

1.2.3基因工程

1.2.4分子标记技术

1.3柑橘童期改良研究进展

1.4类胡萝卜素代谢相关基因克隆及基因工程研究进展

1.4.1类胡萝卜素的生物学功能

1.4.2类胡萝卜素的生物合成途径

1.4.3高等植物类胡萝卜素生物合成途径中主要酶及其基因的研究进展

1.4.4类胡萝卜素代谢调控的主要途径及分子生物学

1.4.5类胡萝卜素生物合成相关基因在植物基因工程中的应用

1.4.6柑橘果实类胡萝卜素代谢研究进展

1.5反义RNA及RNAi技术研究进展

1.5.1反义RNA研究进展

1.5.2 RNAi研究进展

1.6本研究的目的和内容

第二章 早实枳和Cocktail葡萄柚遗传转化体系的建立

2.1材料和方法

2.1.1转化植物材料

2.1.2菌株、质粒及试剂

2.1.3实验所用培养基配方

2.1.4遗传转化外植体再生体系的建立

2.1.5根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化

2.1.6 GUS染色及组织化学分析

2.1.7数据统计与分析

2.1.8 DNA提取

2.1.9 PCR检测

2.1.10 Southern blotting检测

2.2结果与分析

2.2.1筛选培养基的确定和再生体系的建立

2.2.2低温处理对种子发芽率和生长势的影响

2.2.3光照处理对外植体再生能力的影响

2.2.4农杆菌菌液浓度对发芽率和转化率的影响

2.2.5共培养条件对再生能力和转化率的影响

2.2.6卡那霉素添加浓度的确认及添加方式对不定芽再生的影响

2.2.7柑橘不同外植体对潮霉素筛选的反应

2.2.8早实枳茎段腋芽的处理

2.2.9抗性芽再生

2.2.10以Cocktail子叶为外植体的转化

2.2.11抗性植株的分子检测和鉴定

2.2.12转基因植株的GUS染色

2.2.13转基因早实枳开花结果

2.3讨论

2.3.1早实枳在柑橘等木本植物功能基因组和遗传育种研究中的优势

2.3.2早实枳与枳转化和再生的差异

第三章 BCH，CRTISO，LCYB，LCYE RNAi(或反义)载体的构建和转化

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2引物设计

3.1.3植物表达载体构建

3.1.4 CABCH载体转化伏令夏橙胚性愈伤组织

3.1.5 BICI载体转化早实枳

3.1.6 IX2YE和LCYB RNAi载体转化早实枳和Cocktail葡萄柚

3.1.7抗性愈伤和转基因植株PCR测定

3.1.8抗性愈伤和转基因植株Southern杂交分析

3.1.9抗性愈伤和转基因植株叶片类胡萝卜素含量测定

3.1.10转基因植株Real-time PCR分析

3.2结果与分析

3.2.1载体构建

3.2.2转基因愈伤或植株的获得

3.2.3 PCR检测和Southem分析

3.2.4转化BCH反义基因的抗性愈伤组织中类胡萝卜素含量的变化

3.2.5抑制LCYE基因表达对早实枳和Cocktail葡萄柚叶片类胡萝卜素含量和基因表达的影响

3.2.6抑制LCYB基因表达对早实枳叶片中基因表达和类胡萝卜素含量的影响

3.3讨论

3.3.1转基因植株叶片中类胡萝卜素的合成及相关基因的表达

3.3.2 RNAi技术在柑橘功能基因研究及类胡萝卜素代谢调控中的应用潜力

3.4研究展望

参考文献

博士期间发表的论文

致谢