辣椒高效遗传转化体系的建立及其在NAC，CDPK，CIPK等候选基因遗传转化中的应用

摘要

辣椒(Capsicum annuum L)是一种重要的蔬菜和工业原料作物，遗传转化是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础。但是，目前辣椒的遗传转化体系还不完善，主要缺陷是：辣椒再生周期长，分化频率低，不定芽的伸长能力差，遗传转化频率低等，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展，亟待建立高效的遗传转化体系。本研究采用L120，L63(朝天椒)， L3(本地种)，L5(天鹰小椒)等九种辣椒资源，对辣椒再生的芽诱导，芽伸长和生根的激素配比，培养基的选择，基因型，外植体类型进行了比较分析，建立起了辣椒再生体系，并在再生体系的基础上对辣椒遗传转化的预培养，共培养和侵染的时间，Kan筛选浓度进行了反复实验，建立了高效的遗传转化体系，通过农杆菌介导的叶盘法和Flamingo-bill外植体遗传转化法，并应用该体系对NAC1、CDPK和CIPK等候选基因的超表达和RNAi载体进行遗传转化，一方面验证该遗传转化体系应用效率，另一方面为进一步开展所选用的候选基因的功能鉴定奠定基础。试验的主要结论如下： 1、离体再生体系的建立 在辣椒再生过程中，不同外植体的芽诱导差别较大，其中带柄子叶>子叶>下胚轴。苗龄为12-16d的外植体最适宜再生诱导，辣椒基因型直接着影响芽诱导率。经过筛选激素配比，得出以下各阶段培养基配方：子叶芽分化培养基：MB+5mg/L6-BA+0.1mg/L IAA+4mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉；下胚轴芽分化培养基：MB+3mg/L6-BA+1mg/L IAA+4mg/LAgNO3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉；芽伸长培养基：MB+3 mg/L6-BA+1 mg/L IAA+1.5 mg/LGA3+4mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉；生根培养基1/2MB+0.2mg/L IAA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉；6-BA+1AA+ GA3配方的伸长效果优于ZT+ GA3的配方。GA3与ABA的相比较，GA3更利于芽的伸长。诱导芽经过18-22d左右的分化培养最适宜后期的伸长生长。 2、遗传转化体系的建立与优化 遗传转化过程中，不同生长阶段的选择压有区别，芽分化阶段采用75 mg/L的Kan，芽伸长阶段，子叶和下胚轴分别用50 mg/L和75mg/L Kan进行选择，分化和伸长阶段均使用500mg/L羧苄青霉素能有效抑制农杆菌的生长。生根阶段的Kan浓度为40 mg/L，并以200 mg/L的头孢霉素代替羧苄青霉素，有利于根的形成。预培养最佳时间3d，共培养2d。OD600=0.6的农杆菌侵染适宜时间为6～8min。Flamingo-bill外植体法，带柄子叶，子叶块的遗传转化率分别是6.8％，12.1％，4.3％，阳性转化率分别是33％，23.6％，21.1％。 3、遗传转化体系的应用与候选基因转化植株的获得 应用遗传转化体系和L120辣椒基因型对超表达载体和RNAi载体的NAC1基因以及候选基因CDPK和CIPK进行了遗传转化，其中超表达载体NAC1获得25植株，阳性转化率为24％，PCR阳性植株6株；RNAi载体NAC1获得20植株，阳性转化率为25％，PCR阳性植株5株。转化CDPK和CIPK基因获得5株阳性植株。

目录

文摘

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论文说明：缩略词中英文对照表

声明

1.文献综述

1.1遗传转化体系的建立

1.1.1一般遗传转化方法的概述

1.1.2辣椒离体再生体系

1.1.3农杆菌介导的辣椒遗传转化

1.2植物候选基因的功能鉴定

1.2.1超表达分析

1.2.2 RNAi分析

1.3辣椒基因工程中存在的主要问题及对策

2 辣椒外植体的离体培养及再生体系的建立

2.1.材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2.结果与分析

2.2.1不定芽诱导分化最佳培养基筛选

2.2.2不定芽伸长的最佳培养基筛选

2.2.3诱导芽的生根培养与栽培

2.3.讨论

2.3.1.基因型、外植体类型对辣椒再生的影响

2.3.2.激素配比的筛选

2.3.3.硝酸银在芽诱导中的作用

2.3.4.苗龄对芽诱导的影响

2.3.5.B5有机成分对再生苗的影响

2.3.6.不同诱导时间对不定芽伸长的影响

2.3.7.诱导芽的生根

2.3.8.培养环境对再生的影响

3.农杆菌介导的辣椒转化体系的建立与应用

3.1.材料

3.1.1质粒和农杆菌菌株

3.1.2辣椒品种

3.1.3试验用培养基

3.1.4主要药品试剂

3.1.5重要试剂的配制

3.1.6仪器设备

3.2.方法

3.2.1.叶盘法

3.2.2.Flamingo-bill外植体法

3.3.结果与分析

3.3.1叶盘法

3.3.2 Flamingo-bill外植体法

3.4转基因苗的获得

3.4.1叶盘法

3.4.2 Flamingo-bill外植体法

3.4.3应用高效遗传转化体系导入CDPK,CIPK基因

3.5.讨论

3.5.1抗生素Kan浓度的筛选

3.5.2预培养对遗传转化的影响

3.5.3农杆菌浓度和侵染时间对遗传转化的影响

3.5.4共培养时间和温度对遗传转化的影响

3.5.5外植体类型对遗传转化的影响

3.5.6 Flamingo-bill外植体法转化体系

结论

参考文献

致谢