新型甘蓝型油菜核不育系的选育及隐性上位基因Bn;Rf的定位

摘要

油菜是我国主要的油料作物，其中甘蓝型油菜种植最为广泛。与其它类型的油菜相比，甘蓝型油菜驯化时间较短、种质资源较为狭窄，因而限制了其杂种优势潜力的发掘。为了充分发挥杂交种的优势，必须拓宽甘蓝型油菜亲本间的遗传差异。7-750（ArArCnCn）是一种新型的甘蓝型油菜，具有部分白菜型油菜的遗传背景。将这种新油菜与普通的甘蓝型油菜配组，将为甘蓝型油菜强优势组合的选择提供一条可能的途径。
　　 利用杂种优势时，在具有强优势组合的基础上，还需要有一个经济有效的授粉控制系统，以保证杂交种子质量、降低生产成本。7-7365AB是隐性细胞核雄性不育纯合两型系，其不育性彻底、稳定，恢复源广泛，而且可以通过临保系7.7365C的使用模拟质不育，实现三系化制种。因此在本研究中，我们尝试将隐性核不育系7-7365A中的核不育基因导入到新型甘蓝型油菜7-750（ArArCnCn）中，培育新型甘蓝型油菜核不育系7-750A。并且将这种新不育系与普通的甘蓝型油菜配制组合，以选育出优良的杂交组合。
　　 7-7365AB的可育性受到2对隐性不育基因（Bn；ms3和Bn；ms4）和一对隐性上位基因（Bn；rJ）控制。由于涉及到3对基因，通过传统方法对不育系以及临保系的选择都较为困难。尤其对于临保系的选择，由于没有对应的表型，只能通过广泛测交鉴定，使得选育工作更加困难。因此鉴定与．Bn；ms3、Bn；ms4和．Bn；rf连锁的分子标记将为不育系、尤其是临保系的选育提供有效的手段。
　　 本研究以具有亚基因组杂种优势的材料7-750、隐性细胞核雄性不育两型系7-7365AB及其临保系7-7365C作为基础材料，对隐性上位基因Bn；Rf进行遗传定位，同时采用分子标记辅助选择与回交育种相结合，选育具有亚基因组杂种优势的新型甘蓝型油菜核不育系。研究结果如下：
　　 1．用甘蓝型油菜纯合两型系7-7365AB中的不育单株与7-7365C杂交再与7-7365C回交构建BC1分离群体。育性调查结果显示，可育单株与不育单株满足1：1的分离比。该BC1分离群体用于Bn；Rf基因的定位。
　　 2．在回交分离群体（7-7365A×7-7365C）×7-7365C中，构建了2对基因池（BF1和BS1：BF2和BS2），运用BSA法与AFLP分析相结合，共筛选768对AFLP引物组合（预扩增引物组合为PO/MC、PO/MG和EA/MC），获得9个与目标基因Bn；Rf紧密连锁的标记，命名为XM1-XM9。用这9个标记去分析包含351个单株的BC1分离群体，发现标记XM5与目标基因共分离，XM2位于基因一侧，其余7个标记均位于基因另一侧。标记XM3和XM2分别为两侧最近标记，与Bn；Rf之间的遗传距离分别为0.6 cM和2.6 cM。
　　 3．利用连锁分析中获得的交换单株，构建2对基因池（BF3和BS3；BF4和BS4）筛选更多与目标基因连锁更为紧密的标记。共筛选768对引物组合（预扩增引物组合为EA/MG、SA/MC和SA/MG），获得4个与目标基因紧密连锁的标记，命名为XM10-XM13。通过分析发现，这4个标记与目标基因共分离。
　　 4．在本研究之前，发现了3个与Bn；Rf基因紧密连锁的SSR标记（涂金星，未发表），其中的一个标记F09/10在本研究的BC1群体中，仍表现为与目标基因紧密连锁，通过连锁分析发现该标记与XM2位于同侧，与Bn；Rf基因间的遗传距离为3.2cM。
　　 5．将获得的13个AFLP标记，1个SSR标记分别回收、克隆，其中有7个AFLP片段（XM2、XM9、XM6、XM5、XM4、XM10、XM13）和1个SSR片段（F09/F10）成功被克隆、测序。两个片段XM5和XM13被成功转化为SCAR标记，分别命名为XSC5和XSC13。
　　 6．为了获得更多的序列信息，通过PCR-walking的方法成功分离了5个片段（XM2、XM9、XM6、XM4、F09/10）的侧翼序列，将其分别延伸至1399bp、1903bp、951 bp、2092 bp和888 bp。用BLASTN分析检测Bn；Rf位点与拟南芥之间的同源性，共有4个标记与拟南芥基因组的2个区域有同源性。这2个区域分别为拟南芥第1染色体上2.0Mb的一段区域以及第3染色体上一段4.2Mb的区域。
　　 7．利用DH群体（Tapidor×Ningyou7）对Bn；Rf基因进行遗传定位。与Bn；Rf基因连锁的标记XM1被定位于N7连锁群STS标记IGF2021z和RFLP标记px116a之间。从参考图谱的N7连锁群上挑选SSR标记分析本研究的基因池及BC1群体，发现标记BRMS018（Chen et al，2007）和CB10594（Piquemal et al，2005）与Bn；Rf基因连锁，遗传距离分别为14.3cM和27.4cM，进一步证实了Bn；Rf基因的位置。
　　 8．通过分子标记辅助选择（MAS）与传统表型选择及品质分析相结合，应用回交转育的方法，将隐性核不育系7-7365A的不育基因导入到新型甘蓝型油菜7-750中。在前两轮的辅助选择中，在花期对分离群体中的不育单株进行背景分析，选择3个单株与7-750回交，收获后，通过品质分析、同时结合田间表现选择一个株系进入下一轮的辅助选择。
　　 9．在第3轮的辅助选择中，利用本研究室发展的与不育基因（Bn；ms3和Bn；ms4）连锁的标记，在苗期对群体中的单株进行前景选择，分别选择不育单株（Bn；ms3ms3ms4ms4RfRf）和保持单株（Bn；Ms3ms3ms4 ms4RfRf），然后对中选单株进行背景分析，在花期结合田间表现选择候选A、B单株进行兄妹交。
　　 10．在兄妹交一代的分离群体中，选择田间表现较好的不育单株与9个恢复系配制杂交组合，同时用改良前的不育系也与9个恢复系配制组合。18个杂交组合、亲本及对照于2007年秋播种，随机区组设计设置3次重复。第二年五月考种，共考察10个产量相关性状。结果表明，8个改后组合的产量超过了相应的改前组合，其中有3个组合（7-7365-1×7-107、7-7365-1×7-138和7-7365-1×7-1260）的产量超过对照中油杂2号10％以上，超标优势率分别为18.18％，12.78％和12.78％。
　　 11．配合力分析表明，改良后的新型甘蓝型油菜核不育系的一般配合力效应值，除分枝部位和千粒重表现为负值之外，其余的8个性状均为正效应，且株高、一次分枝、主花序长度、主花序角果数、全株角果数和单株产量显著高于改良前的不育系（7-7365A），说明了白菜型油菜基因组中的确存在提高甘蓝型油菜产量潜力的遗传成分。
　　 12．通过相关分析得知，遗传距离与F1多数性状的一般配合力相关性不显著。遗传距离与小区产量的一般配合力相关性不显著，与小区产量的特殊配合力表现正相关，相关系数接近显著水平。
　　 13．通过分子标记辅助选择（MAS）与传统表型选择相结合，应用回交转育的方法，初步选育与新不育系具有相似遗传背景的临保系。到目前为止进行了1次背景选择。

目录

文摘

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论文说明：缩略语表

声明

1.文献综述

1.1杂种优势表现的遗传基础

1.1.1显性假说

1.1.2超显性假说

1.1.3基因网络学说

1.2遗传距离与杂种优势

1.3油菜杂种优势利用的主要途径

1.3.1细胞质雄性不育

1.3.2细胞核雄性不育

1.4油菜细胞核雄性不育的研究

1.4.1油菜细胞核雄性不育的细胞学研究

1.4.2油菜细胞核雄性不育的遗传研究

1.5分子标记技术在油菜育种中的应用

1.5.1选用分子标记的特点

1.5.2构建遗传图谱

1.5.3重要性状的基因定位

1.5.4分子标记辅助选择

1.6芸薹属不同基因组亲缘关系的研究

1.6.1芸薹属的起源和进化

1.6.2芸薹属A、B和C基因组染色体配对

1.6.3芸薹属的比较基因组学研究

1.7本研究的目的和意义

2.甘蓝型油菜隐性上位基因Bm;Rf的定位

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2 DNA提取及样品池的构建

2.1.3 AFLP与BSA分析

2.1.4 SSR分析

2.1.5 SCAR标记转化

2.1.6 PCR步行

2.1.7标记位点与拟南芥同源位点的共线性分析

2.1.8连锁遗传分析

2.2结果与分析

2.2.1 Bn；Rf基因的遗传分析

2.2.2与Bn；Rf基因连锁的AFLP标记

2.2.3与Bn；Rf基因连锁的SSR标记

2.2.4 Bn；Rf基因标记的连锁分析

2.2.5利用重组单株鉴定AFLP标记

2.2.6差异片段的回收克隆

2.2.7 SCAR标记转化

2.2.8 AFLP标记的侧翼延伸

2.2.9标记位点序列的生物信息学分析

2.2.10 Bn；Rf基因的图谱定位

2.3讨论

2.3.1AFLP标记的转化

2.3.2标记位点与拟南芥同源位点共线性分析

3.分子标记辅助选择新遗传背景的甘蓝型油菜核不育系

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1材料

3.2.2标记辅助选择的分子标记

3.2.3 DNA抽提和PCR分析

3.2.4田间杂交和标记辅助选择方案

3.2.5性状考察和品质分析

3.2.6数据统计和分析

3.3结果与分析

3.3.1 F2不育单株的外源含量分析

3.3.2 BC1F2的品质分析

3.3.3 BC1F3不育株的外源含量分析

3.3.4 BC2F3品质分析

3.3.5 BC2F4不育株的标记辅助选择

3.4讨论

4.新不育系同源的临保系的选育

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2标记辅助选择的分子标记

4.1.3 DNA抽提和PCR分析

4.1.4田间杂交和标记辅助选择方案

4.2结果与分析

4.2.1 S4可育单株的外源含量分析

4.3讨论

5.新型甘蓝型油菜核不育系配合力评价

5.1材料和方法

5.1.1试验材料

5.1.2田间种植和性状考察

5.1.3配合力测定

5.1.4杂种优势测定

5.1.5数据统计分析

5.2结果分析

5.2.1新不育系配制杂交组合的表现

5.2.2产量及相关性状的方差分析

5.2.3配合力相对效应值的分析

5.2.4杂种优势与遗传距离间的相关性分析

5.2.5新不育系与9个恢复系所配杂交种的品质性状表现

5.3讨论

参考文献

附录

致谢