云南直缘乌头活性成分分析及毒性检测方法的研究

摘要

云南直缘乌头(Aconitum Transsectum Diels)又名大草乌、小黑牛，产于中国云南西北部。本实验以云南野生型和栽培型直缘乌头作为材料，使用传统的中药炮制方法（蒸煮）进行逐步脱毒，通过 HPLC-UV和 HPLC-MS对其活性成分含量和结构进行分析，旨在对经过脱毒后的直缘乌头毒性进行评估，并研究快速检测毒性的方法。
　　1、直缘乌头基本成分分析
　　采用容量法和比色法测定了不同材料（野生生长与人工栽培的直缘乌头）、不同蒸煮时间（常压下蒸煮1h、3h、6h、9h、12h；加压下蒸煮1h、2h、4h）、不同的蒸煮方式（加压和常压）间直缘乌头总生物碱、游离氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白质的含量。结果表明，可溶性糖占直缘乌头干重的25%-52%；可溶性蛋白质占直缘乌头干重的0.45%-0.89%；游离氨基酸占直缘乌头干重的0.45%-0.96%；总生物碱在野生型生药样中含量为0.023mol/g，在栽培型生药样品中含量为0.020mol/g。从测得的结果看来，可溶性糖是直缘乌头中的主要成分，野生型直缘乌头总生物碱含量要高于栽培型，蒸煮时间和方式对总生物碱量没有很大改变。
　　2、直缘乌头毒性成分分析
　　采用有机溶剂提取法提取毒性成分，通过HPLC-UV和HPLC-MS进行检测，对不同处理的直缘乌头中毒性成分进行定性和定量分析。结果表明，不经蒸煮的直缘乌头主要存在保留时间为10.9、17.8、26.1、37.0、56.8、71.9min的生物碱，其分子量分别为421、463、433、601、541、659。经蒸煮处理的样品则主要存在保留时间为10.9、15.4、17.8、23.1、26.1、56.8和70.7min的生物碱，其分子量分别为421、391、463、617、433、541、659。根据分子量推测，其中保留时间为10.9min、23.1min、70.7min的物质可能为塔拉萨敏、8-去乙酰滇乌碱和滇乌碱，其中具有代表性的滇乌碱为毒性较大的双酯型二萜生物碱，在不经蒸煮的直缘乌头中含量较高。结果还表明，无论是生药样还是蒸煮样，野生型和栽培型直缘乌头其生物碱组成成分没有差异，但分子量大的生物碱在不经蒸煮的直缘乌头中含量较高。常压蒸煮时间达6h以上的样品，基本不含有分子量大的生物碱。在蒸煮过程前期，生物碱组成成分与含量变化十分明显，到了蒸煮后期，含量变化趋缓。由此说明常压蒸煮超过6h，加压蒸煮达到4h可达到脱毒的目的，而且加压短时蒸煮与常压长时蒸煮的具有同样的脱毒效果。
　　3、毒性检测方法的研究
　　（1）试剂筛选
　　在生草乌的 W浸提液中，分别加入 A、B、C、D、E试剂，观察显色情况，发现用高浓度的 W试剂浸提，再向浸提液中加入 D试剂能达到很好的检测效果，由此确定检测试剂为D和高浓度的W试剂。
　　（2）试剂优化
　　通过对呈色物质的全波长扫描，得到其最大吸收波长为522nm；通过在不同时间段对呈色物质进行比色测定，发现该呈色物质具有良好的稳定性；通过正交试验确定了实验室检测最佳条件，即 W浓度为90%、D浓度为0.08mL/mL、草乌样品的加入量为0.8g、反应环境温度为20℃。
　　（3）毒性检测
　　使用检测试剂对不同处理的样品进行显色，发现不经蒸煮的生草乌显绯红色，经蒸煮过的草乌，颜色随蒸煮时间的延长绯红色逐渐变淡，最后转变为淡黄色；经比色测定，生草乌的吸光值为0.706，而经常压蒸煮12h的熟草乌，其吸光值为0.115；其比色结果与液相检测结果相对应。可以确定该检测试剂能够简便、快速、有效地检测直缘乌头的毒性。

目录

英文缩写词语表

第一章文献综述

1植物学特征

2二萜类生物碱的测定方法

3二萜类生物碱的结构

4二萜生物碱的药理研究

5中毒诊断及救治

6应用研究及其展望

7研究的目的及意义

第二章直缘乌头基本成分分析

1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

第三章直缘乌头毒性成分分析

1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

第四章毒性检测方法的研究

1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢