禽流感假病毒体系的建立及猪流感多重RT-PCR诊断方法的建立

摘要

禽流感（Avian influenza）是由禽流感病毒（Avian influenza virus）引起的一种常见的禽类传染病。被世界动物卫生组织（OIE）和我国定为A类传染病。近年来，AI出现了新特点，尤其是高致病性禽流感病毒（HPAIV）通过抗原漂移和抗原转变，已获得了感染人并造成死亡的能力，这赋予了HPAIV更重要的公共卫生学意义。目前，AIV致病机理研究深入，但仍存在一些机制未阐明，其中，血凝素蛋白（HA）是病毒入侵宿主的重要相关因子，并介导病毒吸附与胞膜融合。HA以细胞表面的唾液酸残基（SA）为受体，是受体结合蛋白，并能激发宿主产生免疫反应，是研究禽流感病毒入侵宿主细胞的好模型。假病毒是人们研究病毒与宿主细胞之间相互关系的一种工具，它与真病毒相比不但囊膜上具有仅供研究的目的糖蛋白，无其他蛋白的干扰，而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被修饰掉，是复制缺陷型，所以这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，生物安全性比较强。因此本实验尝试选择表达含HA蛋白的假病毒用以研究AIV入侵宿主细胞的机制。
　　 1禽流感病毒A/duck/Hubei/W1/2004（H9N2）株AIV HA蛋白假病毒的构建
　　 将禽流感病毒H9N2亚型的HA蛋白整合到HIV-1构件的核衣壳内，包装成假病毒颗粒（HIV/H9-HA）。根据A/duck/Hubei/W1/2004（H9N2） AIV HA基因的核苷酸序列采用RT-PCR克隆了完整的HA基因序列至pcDNA3.1（+）中，得到转移载体pBHHA9。通过与含有HIV-1 gag/pol构件的载体pCMVΔ8.2以及含有β-半乳糖苷酶报告基因的pHR．'-CMVLacZ共转染293T细胞包装成假病毒HIV/H9-HA。Western blot检测的HA假病毒颗粒表达结果显示出特异性目的带，其大小与HA蛋白大小相符，说明HA在假病毒颗粒表面得到了表达。通过LacZ染色，感染293T细胞，证明假病毒对细胞具有感染性。通过鸡红细胞凝集试验证明表达HA蛋白的假病毒粒子可以与细胞表面的受体结合并使鸡红细胞发生凝集反应，其凝血效价达到23。为检验HIV/H9-HA是否如同天然禽流感病毒那样有着广泛的细胞嗜性，用HIV/H9-HA感染了MDCK等4种细胞，实验结果表明，HIV/H9-HA可以感染多种哺乳动物细胞。
　　 猪流感（Swine Influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza virus，SIV）引起猪的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病。SIV不但给养猪业带来巨大损失，同样具有重要的公共卫生学意义。传统的病毒分离鉴定方法费时费力，不能快速准确的确诊SI，因此本实验选择以亚型特异性的HA蛋白为靶，尝试建立多重RT-PCR检测方法用以进行猪流感的快速检测及分型。
　　 2猪流感多重RT-PCR诊断方法的建立
　　 参照GenBank中发表的猪流感病毒HA三个亚型（H1，H3，H5）的所有基因序列，应用生物软件分别对其进行分析筛选，设计了针对猪流感病毒HA三个亚型的特异性引物，建立猪流感多重RT-PCR诊断方法。特异性试验中扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒，猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒等病毒为阴性，交叉试验未出现非特异性条带。优化试验条件后其灵敏度有所提高。在对临床样本的检测中，多重RT-PCR方法与鸡胚病毒分离阳性符合率为100％，说明此方法真实可靠，可以运用于临床。
　　 本研究建立了表达禽流感H9亚型HA蛋白的低致病性禽流感假病毒技术模型，为进一步对禽流感病毒受体、中和表位等方面的研究，以及抗流感病毒药物的筛选提供了一种思路和技术支持。本研究同时建立了猪流感多重RT-PCR诊断方法，为在临床中快速准确的诊断猪流感提供了条件。

目录

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论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1.1禽流感病毒特性及研究进展

1.1.1禽流感病毒病原学综述

1.1.2禽流感的流行病学调查

1.2猪流感的流行病学概述

1.3血凝素基因的研究

1.3.1 HA切割位点与毒力的关系

1.3.2 HA蛋白在入侵宿主细胞过程中的作用

1.3.3 HA对宿主的免疫保护作用

1.4流感检测技术

1.4.1流感的经典诊断方法

1.4.2流感的分子生物学诊断技术

1.5逆转录病毒载体系统的研究进展

1.5.1逆转录病毒载体系统基本原理

1.5.2假病毒体系

1.5.3逆转录病毒表达系统的应用

第二章禽流感病毒A／duck／Hubei／W1／2004(H9N2)株HA蛋白假病毒的建立

2.1研究目的与意义

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1 HA基因的RT-PCR扩增结果

2.3.2转移载体的构建

2.3.3 Western-blot结果

2.3.4 LacZ染色

2.3.5血凝价的检测(HA)

2.3.6 HA假病毒颗粒对不同细胞的感染

2.3.7 HA假病毒颗粒pH值依赖性测

2.4讨论

2.5结论

第三章 猪流感H1、H3、H5亚型多重RT-PCR诊断方法的建立

3.1研究目的与意义

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5结论

参考文献

致谢