水稻OsIAA和OsGSK基因家族系统分析和OsIAA1基因功能鉴定

摘要

植物激素研究的成果是人类进行作物遗传改良和育种的重要理论源头，对作物遗传改良和育种的实践起到了很重要的作用。生长素调控很多复杂的生理过程，影响植物的顶端优势，侧根的形成，重力反应，胚胎发生，微管分化，也影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老。油菜素内酯是与植物细胞的生长、分裂、分化和生殖有关的多羟基化的类固醇植物激素。在拟南芥中，对这两类激素的信号传递已经有了比较详尽的研究，但是在水稻这种作为全球最重要的粮食作物以及禾谷类作物的模式植物中，研究相对较少。
　　 本研究旨在对水稻中分别在生长素和油菜素内酯信号途径发挥重要作用的两个基因家族（OsIAA和OsGSK）进行系统的分析，同时鉴定其中一些成员的功能。主要内容包括三个方面：一是分析OsIAA基因家族在各个发育阶段以及在各种激素和逆境处理下的表达模式；二是系统分析水稻Glycogen shaggy-like kinase基因家族在水稻中的情况，并对OsGSK在各个发育阶段以及各种激素和逆境处理下的表达模式进行了分析。三是对3个OsIAA基因进行了初步的功能分析，较深入的研究了OsIAA1在油菜素内酯和生长素信号中的相互作用的功能。主要结果如下：
　　 OsIAA家族分析结果：
　　 1．对31个OsIAA家族基因在水稻全生育期的表达分析发现多数OsIAAs是组成型表达的。同时分析了与OsIAA互作的OsARF家族基因的表达谱，发现多数OsARF具有组织特异性的表达模式，并且在幼穗中有比较高的表达。聚类分析发现有8对OsIAA-OsARFs存在类似的表达模式，可能共同参与某一特定发育过程。
　　 2．对OsIAAs在不同激素和逆境处理下的表达分析发现，多数OsIAAs不仅受激素诱导同时也受逆境诱导，暗示OsIAAs可能即参与激素应答，也参与逆境反应。
　　 3．分析甘露醇处理下DR5-GUS转基因植株根的表型以及DR5-GUS表达模式的变化发现逆境信号（甘露醇处理）引起生长素的再分布，进一步说明逆境和生长素信号传递途径可能存在相互作用。
　　 OsIAA基因的功能研究
　　 1．通过RT-PCR，OsIAA1-Promoter-GFP，real-time PCR以及芯片数据分析OsIAA1的表达模式，发现该基因是一个组成型表达的基因，并受多种激素的诱导。
　　 2．用ubiquitin启动子驱动OsIAA1超表达发现，转基因植株对生长素的反应下降，对油菜素内酯的感应上升。超表达植株出现叶夹角增大，植株变矮的表型，说明OsIAA1可能同时参与了生长素和油菜素内酯的信号传导。
　　 3．对OsIAA1的互作蛋白分析发现，OsIAA1与OsARF1互作，分析OsARF1的突变体发现，osarf1对油菜素内酯的反应与超表达OsIAA1的植株相类似，说明OsIAA1与OsARF1共同参与生长素和油菜素内酯的信号传导。
　　 4．分析OsIAA1超表达植株中一些生长素和油菜素内酯的应答基因的表达情况发现，转基因植株同时改变了这两种激素应答的基因的表达模式。进一步证明了OsIAA1介导了生长素和油菜素内酯的信号传导。
　　 5．超表达OsIAA4表现出分蘖角增大，植株变矮，对生长素反应下降等表型。
　　 6．对OsIAA9自身启动子的分析发现，OsIAA9为根和胚芽鞘特异表达基因，在根中表达模式与DR5-GUS相似。超表达OsIAA9表现出对生长素反应下降等表型。
　　 对OsGSK家族的分析结果：
　　 1．序列分析发现水稻中有9个OsGSK成员，分别定位在第1，3，5，6和9染色体上。蛋白序列分析发现所有成员都含有一个非常保守的激酶结构域。
　　 2．对OsGSKs在水稻全生育期的表达分析发现OsGSKs的表达水平都很高，说明该基因家族在水稻的生长发育中发挥着重要作用。
　　 3．对OsGSKs在各种激素和逆境的表达谱分析发现，多数OsGSKs参与激素和逆境应答，暗示该基因家族参与多种激素的途径，以及可能在逆境中发挥功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写名词表

声明

1.文献综述

1.1生长素的信号传导

1.1.1生长素受体

1.1.2.Aux/IAA基因

1.1.3 GH3基因

1.1.4 SAUR基因

1.1.5 ARF(auxin response factor)基因

1.1.6.ARF和Aux/IAA共同调节生长素反应基因模型

1.1.7生长素反应基因启动子，启动子元件

1.1.8生长素在核内的信号传导

1.2油菜素内酯的信号传导

1.2.1 BRI1-BR受体，BR信号感知的主要成分

1.2.2 BAK1-与BRI1形成异源二聚体，参与BR信号转导

1.2.3 BRS1-在BR信号途径的早期发挥作用

1.2.4 BRI1的两个下游信号组分-TTL和TRIP-1

1.2.5 BKI1(BRI1-interacting protein)-负调控BR信号传递途径

1.2.6 BSKs-与BRI1互作，位于BRI1下游，BIN2上游

1.2.7 BIN2-BR信号传导的负调控因子

1.2.8 BIN2的下游信号分子一核定位蛋白BZR1和BES

1.2.9 BSU1-直接与BSK互作，调控BES1和BIN2的磷酸化状态

1.2.10油菜素内酯的信号传导模型

1.3生长素和油菜素内酯在信号传导上的相互作用

1.3.1生长素和油菜素内酯协同效应：生理实验证据

1.3.2互作概念的提出

1.3.3生长素和油菜素内酯的信号传导途径

1.3.4受油菜素内酯调节的基因的表达

1.3.5生长素和油菜素内酯在基因表达水平上的互作

1.3.6生长素和油菜素内酯共同调控基因的表达：在那个水平上?

1.3.7生长素和油菜素内酯信号途径汇聚于调控基因元件上

1.3.8 ARF2介导了生长素和油菜素内酯信号途径

1.4 GSK家族

1.4.1动物GSK-3参与胰岛素信号途径

1.4.2动物GSK-3在发育中的功能

1.4.3动物GSK-3的目标蛋白

1.4.4植物GSKs的克隆

1.4.5植物GSKs的生物学功能

1.4.6参与胁迫反应

1.4.7参与发育的调控

1.4.8参与激素信号转导

1.5本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1水稻材料

2.2实验所用到的菌株、质粒、载体

2.3 DNA的抽提和Southern杂交

2.4 RNA的抽提和Northern杂交

2.5 PCR、RT-PCR和Real-time PCR的检测

2.6遗传转化载体的构建和转化

2.6.1超量表达载体的构建

2.6.2 GFP及GUS融合表达载体的构建

2.6.3遗传转化

2.7目标蛋白的亚细胞定位分析

2.8酵母双杂交

2.9 GFP的表达观察

2.10水稻的激素处理

2.11水稻的逆境处理

2.12超表达植株激素处理

3结果与分析

3.1AUX/IAA家族分析

3.1.1水稻Aux/IAAs基因信息

3.1.2水稻Aux/IAA基因和蛋白结构

3.1.3水稻OsIAA与OsARF基因在全生育期的表达分析

3.1.4水稻OsIAAs在各种激素处理下的表达分析

3.1.5水稻OsIAA在旱、盐处理下的表达分析

3.1.6水稻OsIAAs和OsARFs对光的反应

3.1.7甘露醇处理下水稻根生长变化与生长素的重新分布有关

3.2 OsIAA1参与油菜素内酯和生长素的反应以及植物的形态建成

3.2.1水稻中OsIAA1的鉴定

3.2.2超表达OsIAA1的表型变化

3.2.3超表达OsIAA1降低了植株对生长素的响应

3.2.4超表达OsIAA1增加了植株对油菜素内酯的响应

3.2.5 OsIAA1与OsARF1的互作及osarf1突变体表型分析

3.2.6 OsIAA1超表达改变了油菜素内酯和生长素反应基因的表达情况

3.3其它OsIAA基因的转基因植株分析

3.3.1 OsIAA9基因

3.3.2 OsIAA4基因

3.4水稻OsGSK家族分析

3.4.1 OsGSK家族在水稻中的基本信息

3.4.2水稻和拟南芥OsGSK家族进化分析

3.4.3 OsGSK家族在水稻全生育期的表达情况

3.4.4 OsGSK家族在旱、盐以及ABA处理下的表达情况

3.4.5 OsGSK家族在各种激素处理下的表达情况

4讨论

4.1 OsIAA家族参与多种激素和逆境应答

4.2 OsIAA1参与了生长素和油菜素内酯的信号途径以及参与植物的形态建成

4.3水稻GSK家族

参考文献

附录

致谢