猪骨骼肌肌肉肥大和肌纤维转化通路中相关功能基因的表达规律研究

摘要

IGF-I介导的mTOR/PKB信号通路在调控骨骼肌出生后的肥大发育中发挥着重要作用,而CaN/NFATc1信号通路可以调控出生后肌纤维类型转化,促进快肌纤维向慢肌纤维转化,从而提高了氧化型纤维的比例并促使猪肉品质更加优良。本研究以实验室前期应用基因芯片技术在四月龄中外猪种(大白猪、梅山猪)背最长肌中鉴定的差异表达基因信息为基础,着重考虑其在生后骨骼肌发育中的生理功能及在上述通路中的作用,一方面从IGF-I-mTOR/PKB和CaN/NFATc1两个信号通路中分别选取了8个、6个功能基因进行分离鉴定、时空表达分析研究;另一方面对CaN/NFATc1信号通路调控的靶基因:MYH1、MYH2、MYH4的5′侧翼序列进行了分离、AT2元件序列的扩增、结构突变的遗传效应分析等研究,为从肌肉生长发育改良肉质提供理论依据。主要研究结果如下:1、分离了GRB2基因(GenBank:FJ196595)完整的CDS序列和PDK1(GenBank:FJ196594)、MEF2D(GenBank:EU878304)、FKBP5基因部分编码区序列。用生物信息学方法推导了猪GRB2基因的氨基酸序列,发现GRB2基因具有特有的Sh2和Sh3保守结构域。2、运用Real-time PCR的方法,检测了IGF-I和CaN/NFATc1两个信号通路中14个基因在大白和通城猪出生后3天、21天、35天、60天、90天和120天六个不同生长发育阶段背最长肌的基因表达谱,发现14个基因中大部分基因在肌肉生长发育后期(60天以后)中外猪种中显著或极显著差异表达。3、以成年大白猪的心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、脂肪、半腱肌、股二头肌、咬肌和背最长肌12种组织为材料,利用半定量RT-PCR检测了上述14个基因的组织表达谱,结果发现GLUT4在心肌和骨骼肌中特异表达,IRS1在骨骼肌中相对高表达,其他基因在所检测的12种组织中几乎都表达。4、分离克隆了3个快肌纤维基因(MYH1、MYH2、MYH4)的5′侧翼序列和其中的AT2元件,结果发现AT2元件序列在大白和通城品种中没有结构突变。5、经过测序和序列比对发现了一个位于MYH4基因5′侧翼序列的SNP位点,并建立了该位点的PCR-AclI-RFLP分子标记检测方法;以华中农业大学试验猪场2003、2004年屠宰的大白猪×梅山猪杂种猪F2代群体为试验猪群,对该位点进行了性状关联分析,初步分析表明该位点与肌内脂肪和肌内水分极显著相关(p<0.01),与背最长肌大理石纹显著相关(p<0.05)。

目录

摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 中外猪种在生长、胴体和肉质性状上的差异及影响因素

1.1.1 中外猪种生长、胴体和肉质性状的差异

1.1.2 中外猪种生长、胴体和肉质性状差异的非遗传因素

1.1.3 中外猪种生长、胴体和肉质性状差异的遗传因素

1.2 中外猪种生长、胴体和肉质性状差异的机理研究概况

1.2.1 生长、胴体和肉质性状的QTL定位

1.2.2 生长、胴体和肉质性状的差异表达EST(基因)研究进展

1.3 肌肉生长发育与肉的生产

1.3.1 肌肉生长发育概述

1.3.2 肌纤维肥大发育与生长、胴体性状

1.3.3 肌纤维类型与肉质性状

1.4 出生后肌纤维肥大发育通路研究进展及相关基因的选择

1.4.1 出生后骨骼肌肥大发育的特点及影响因素

1.4.2 调控出生后骨骼肌肥大发育的通路和机制

1.4.3 通路中相关基因的选择及研究概况

1.5 出生后肌纤维转化通路研究进展及相关基因的选择

1.5.1 中外猪种肌纤维类型转化的特点

1.5.2 调控肌纤维转化的通路和机制

1.5.3 通路中相关基因的选择及研究概况

1.6 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验样品

2.1.2 主要试剂和试剂盒

2.1.3 常用缓冲液和试剂配制

2.1.4 主要仪器设备和耗材

2.1.5 主要分子生物学软件和在线分析工具

2.2 试验方法

2.2.1 猪基因组DNA的提取

2.2.2 猪组织总RNA的提取

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4 猪新基因GRB2、PDK1、MEF2D和FKBP5编码区序列的扩增

2.2.5 PCR产物的回收、克隆和测序

2.2.6 实时定量PCR绘制基因发育表达谱变化

2.2.7 半定量RT-PCR分析组织表达谱

2.2.8 快肌纤维基因5′侧翼序列的研究

3 结果与分析

3.1 猪组织总RNA提取结果

3.2 猪GRB2、PDK1、MEF2D和FKBP5四个新基因编码区序列扩增结果

3.3 IGF-I通路中相关基因的表达分析

3.3.1 同一基因在大白和通城猪六个时期的差异表达

3.3.2 基因表达趋势分析

3.3.3 同一时期各基因在大白和通城猪中的相对表达量

3.3.4 差异表达基因组织表达谱

3.4 CAN/NFATC1通路中相关基因的表达分析

3.4.1 同一基因在大白和通城六个时期的差异表达

3.4.2 基因表达趋势分析

3.4.3 组织表达谱

3.5 快肌纤维基因5′侧翼序列的研究

3.5.1 快肌纤维基因5′侧翼序列扩增结果

3.5.2 快肌纤维基因5′侧翼序列AT2元件分析

3.5.3 MYH4基因5′侧翼序列SNP检测及遗传效应分析

4 讨论

4.1 关于实时荧光定量PCR(QPCR)中内参基因的选择

4.2 关于IGF-I通路和其中的功能基因表达分析

4.2.1 候选基因的时间依赖性表达谱

4.2.2 差异表达基因的组织表达谱

4.3 关于CAN/NFAT通路和其中的功能基因表达分析

4.3.1 候选基因的时间依赖性表达谱

4.3.2 差异表达基因的组织表达谱

4.4 关于快肌纤维5′侧翼序列分析

4.4.1 快肌纤维5′侧翼序列AT2元件分析

4.4.2 MYH4基因SNP检测及遗传效应分析

4.5 下一步工作

5 小结

5.1 本研究的主要结果和结论

5.2 本研究的创新点和特色

参考文献

致谢

附表