肥度性状-耳状QTL重叠区候选基因GDF11和BMP5分离鉴定及遗传效应分析

摘要

根据基因生理生化功能、猪肥度形状和耳状QTL定位结果,选取GDF11基因和BMP5基因作为影响猪肥度性状的候选基因。应用比较基因组学和生物信息学等方法进行候选基因的分离鉴定；采用RT-PCR进行部分基因的组织表达研究；利用PCR-RFLP方法检测两个候选基因共7个单核苷酸多态性；以大梅F2资源家系(322头)为试验材料,进行基因多态性与猪肥度性状关联分析。主要研究结果如下:
　　 1.GDF11基因:
　　 (1)获得猪GDF11基因2562bp的cDNA序列,其中包括1209bp的编码区序列,286bp的5’UTR序列和1065bp的3’UTR序列。(2)利用罗斯林研究所Prof.Archibald提供的SNP信息,建立了第1内含子的PCR-HhaⅠ-RFLP分型技术。(3)遗传标记与肥度性状的关联分析结果表明:HhaⅠ多态位点与大梅F2资源家系猪的体长显著相关(P<0.05),基因加性效应显著(P<0.05)；与肋骨数显著相关(P<0.05),基因加性效应显著(P<0.05)；与臀部背膘厚显著相关(P<0.05),基因加性效应显著(P<0.05);与瘦肉率极显著相关(P<0.01),基因加性效应极显著(P<0.01)。(4)组织表达谱分析表明,GDF11在11个组织中都有表达,其中在肌肉和脂肪组织中高表达,心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中中量表达,在肺、子宫、卵巢、胃和小肠中微量表达。
　　 2.BMP5基因:
　　 (1)获得猪BMP5基因2633bp的cDNA序列,其中包括1456bp的编码区序列,658bp的5’UTR序列和519bp的3’UTR序列。(2)利用罗斯林研究所Prof.Archibald提供和自己获得的SNP信息,建立了BMP5基因第1外显子的PCR-SacⅠ-RFLP分型技术、第1内含子的PCR-HpaⅡ-RFLP分型技术、第3内含子的PCR-RsaⅠ-RFLP分型技术、第5内含子的PCR-PstⅠ-RFLP分型技术、第5内含子的PCR-EcoRⅠ-RFLP分型技术和3’UTR的PCR-RsaⅠ-RFLP分型技术。(3)遗传标记与肥度性状的关联分析结果表明:第3内含子RsaⅠ多态位点与背膘厚显著相关(P<0.05);与内脂和内脂率显著相关(P<0.05)；与肥肉率极显著相关(P<0.01)；与体长显著相关(P<0.05)。(4)组织表达谱分析表明BMP5在肌肉组织中中量表达,在心脏、肺和肾脏中微量表达,其他组织中不表达。(5)构建了2个miRNA重组载体plet-7c和pmir-184,并在成纤维细胞中进行了超表达,实时定量RT-PCR结果显示miRNA在细胞中高表达,半定量RT-PCR结果显示BMP5 mRNA表达减弱,说明let7c和mir-184可能参与了BMP5的表达调控。
　　 上述研究结果显示:GDF11基因第1内含子的HhaⅠ位点和BMP5基因第3内含子的RsaⅠ多态位点可作为猪肥度性状分子遗传标记。对上述基因的分离、鉴定、多态性及表达调控研究有助于我们更深地了解基因的生物学功能,为揭示猪肥度性状分子机理和标记辅助选择的实施提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

基金项目资助

主要性状的中英文对照和英文缩写

第一章 文献综述

1 前言

2 寻找主基因的方法

3 猪肥度性状主效基因研究进展

3.1 猪肥度性状的QTL研究进展

3.2 猪肥度性状候选基因的研究进展

4. 猪耳状等外貌性状QTL的研究进展

4.1 猪耳状QTL的研究进展

4.2 猪其它外型性状QTL的研究进展

5. 猪肥度性状-耳状候选基因BMP5和GDF11基因的研究进展

5.1 BMPs(Bone Morphogenetic Protein)家族

5.2 GDF11(Growth Differentiation Factor 11)基因

5.3 BMP5(Bone Morphogenetic Protein 5)基因

第二章 目的和意义

第三章 材料与方法

1 试验材料

1.1 试验样品

1.2 主要仪器和设备

1.3 主要试剂及溶液

2 试验方法

2.1 基因组DNA的提取

2.2 总RNA的提取

2.3 引物设计与合成

2.4 候选基因片段的扩增

2.5 候选基因的克隆及序列分析

2.6 候选基因多态性分析

2.7 数据处理分析

2.8 候选基因组织表达谱分析

2.9 与候选基因BMP5结合的2个miRNAs表达载体的构建

第四章 结果与分析

1 猪基因组核酸提取及质量检测结果

2 猪GDF11基因

2.1 猪GDF11基因编码区序列克隆及序列分析

2.2 猪GDF11基因结构分析

2.3 猪GDF11基因多态性检测

2.4 猪GDF11基因Hha Ⅰ多态位点与猪肥度性状的关联分析

3 猪BMP5基因

3.1 猪BMP5基因编码区序列克隆及序列分析

3.2 猪BMP5基因部分基因组序列克隆及序列分析

3.3 猪BMP5基因多态性检测

3.4 猪BMP5基因第三内含子Rsa Ⅰ多态位点与猪肥度性状的关联分析

3.5 与BMP5结合的2个miRNAs表达载体的构建

第五章 讨论

1 关于候选基因策略

2 基因序列的获取与分析

3 候选基因结构与遗传变异分析

3.1 基因组结构的分析

3.2 候选基因的遗传变异分析

4 候选基因的SNP与性状关联分析

4.1 GDF11基因的SNP与性状关联分析

4.2 BMP5基因的SNP与性状关联分析

4.3 SNP的应用

5 组织表达谱分析

6 miRNA载体的超表达分析

7 下一步工作

小结

参考文献

致谢

附录1 : GDF11 cDNA序列

附录2 : BMP5 cDNA序列