中华鳖免疫球蛋白连接链和重链基因与抗体产生规律

摘要

中华鳖（Pelodiscus sinensis）是我国重要的淡水养殖动物，对其免疫系统的研究不仅在脊椎动物发育与比较免疫学方面具有重要意义，而且在中华鳖病害防治方面也具有重要的价值。本论文对编码中华鳖免疫球蛋白连接链（Joiningchain）和免疫球蛋白M、D、Y的重链cDNA进行克隆，并揭示这些抗体的表达规律。此外，对中华鳖IgM、IgD和IgY阳性细胞的发生进行了研究。
　　 用RACE-PCR方法扩增出中华鳖免疫球蛋白J（Joining chain）链全长cDNA。其cDNA全长为2，347 nt，包含5’非编码区30 nt，3’非编码区1，834 nt，开放阅读框480 nt，编码160个氨基酸。序列比对分析表明中华鳖免疫球蛋白J链基因与海龟的相似性高达80.7％，与鸡、爪蟾、牛蛙和鳐的相似性分别是71.3％、57.6％、49.4％和35.8％。结合进化树的结果分析，表明中华鳖免疫球蛋白J链基因同鸡的亲缘关系高于同两栖类的关系。用RT-PCR方法，检测到J链基因在中华鳖胚胎受精后5天就有表达，而且持续增加。免疫印迹实验和免疫组化分析表明J链基因组成型表达于中华鳖免疫器官和组织中。荧光定量PCR显示灭活的Aeromonas hydrophilastrain T4可诱导中华鳖免疫球蛋白J链mRNA在脾脏、肾脏和血液中有较高的上调表达，表明免疫球蛋白J链基因在中华鳖早期发育阶段和抵抗微生物感染免疫应答过程中具有重要作用。
　　 到目前为止，只有三种免疫球蛋白分子IgM、IgD和IgA在爬行动物中报道。本研究中，我们克隆了中华鳖lgM、IgD和一种新的免疫球蛋白分子IgY，其中IgM和IgY同其它物种的相应的Ig分子具有相似的特征，而IgD分子结构不同于其它物种，由6个不重复的恒定区组成。利用RT-PCR枪测到IgM和IgD基因在中华鳖胚胎受精后7天就有表达，而且表达量随着发育持续增加。但IgY在孵化后90天才在牌脏和肾脏中检测到微弱的表达。通过免疫印迹实验，在中华鳖主要免疫器官和组织中都检测到三种免疫球蛋白分子IgM、IgD和IgY的表达。免疫组化检测到中华鳖主要免疫器官，如脾脏、肾脏和肠中均有IgM、IgD和IgY阳性细胞。而且，实时荧光定量PCR和间接ELISA分析了灭活嗜水气单胞菌A．hydrophila诱导后中华鳖脾脏、肾脏和血液中各类Ig基因转录水平和血清中IgM、IgD和IgY抗体表达水平的变化，结果显示均有较高的表达上调。利用流式细胞术分析发现只有IgM在脾脏、肾脏和外周血白细胞中有较高的阳性比例。原位杂交检测到IgM阳性细胞首先在孵化后18天出现在中华鳖脾脏中，随后在28天和64天的肾脏和肠中检测到，而IgD和IgY阳性细胞出现时间要晚于IgM。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章 爬行动物的特异性免疫系统：综述

1免疫组织与器官

1.1胸腺

1.2脾脏

1.3黏膜相关淋巴组织

2免疫球蛋白

2.1免疫球蛋白分子的基本结构

2.2免疫球蛋白连接链

2.3免疫球蛋白分子类型的多样性

3本研究的目的及内容

第二章中华鳖免疫球蛋白J链基因的克隆与表达

1前言

2材料与方法

2.1主要仪器

2.2试剂盒与主要试剂

2.3载体和菌株

2.4实验材料

2.5核酸的提取和纯化

2.6 J链cDNA全长的获得与序列分析

2.7中华鳖早期发育阶段J链基因转录水平的表达

2.8实时荧光定量PCR检测J链基因的诱导表达变化

2.9中华鳖J链基因的原核表达

2.10兔多克隆抗体的制备

2.11 Western blotting检测J链基因蛋白水平的表达

2.12免疫组化检测J链基因在组织细胞内的分布

2.13中华鳖免疫球蛋白J链抗体变化规律

3结果

3.1 J链cDNA全长及推导的氨基酸序列特征

3.2 J链基因的系统进化分析

3.3中华鳖早期发育阶段J链基因的表达

3.4 Real-time PCR检测J chain基因的诱导表达变化

3.5中华鳖J链基因的原核表达

3.6 Western blotting检测J链组织蛋白水平的表达

3.7免疫组化分析J链在组织细胞中的定位

3.8中华鳖血清中免疫球蛋白J链的变化规律

4讨论

第三章中华鳖IgM，IgD和IgY重链基因的克隆、表达及其阳性细胞发生

1前言

2材料与方法

2.1中华鳖Igs重链基因cDNA全长获得与序列分析

2.2中华鳖早期发育阶段Igs重链基因转录水平的表达

2.3实时荧光定量PCR检测Igs重链基因的诱导表达变化

2.4中华鳖Igs重链基因的原核表达

2.5 Western blotting检测中华鳖组织Igs蛋白水平的表达

2.6免疫组化检测Igs在中华鳖组织细胞中的定位

2.7间接ELISA检测中华鳖IgM、IgD和IgY的抗体变化

2.8细胞悬液的制备及流式细胞术检测

2.9原位杂交检测中华鳖免疫球蛋白阳性细胞的发生与分布

3结果

3.1 Igs重链cDNA及推导的氨基酸序列特征

3.2 IgM，IgD和IgY氨基酸序列比对和进化分析

3.3 IgM，IgD和IgY的基因结构分析

3.4早期发育阶段Igs重链基因转录水平的表达

3.5 Real-time PCR检测IgM，IgD和IgY的诱导表达变化

3.6中华鳖Igs重链基因的原核表达

3.7 Western blotting检测Igs组织蛋白水平的表达

3.8免疫组化分析Igs在组织细胞中的定位

3.9间接ELISA检测中华鳖受免后血清中抗体水平变化

3.10流式细胞术检测Igs阳性细胞

3.11原位杂交

4讨论

参考文献

附录 攻读博士学位期间论文发表情况

致谢