产纤维素酶菌株的筛选和枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶催化活性的改造

摘要

在过去五十年里，许多学者对纤维素酶进行了大量的研究，试图转化地球上大量、可再生的纤维素资源为可利用的生物能源，以代替日益枯竭的石化能源。然而，纤维素酶生产的高成本严重制约了纤维素生物转化产业的发展，解决这一问题的关键就是寻找新的高产菌株或通过分子生物学技术改造纤维素酶的催化活性，以此来提高酶的生物转化效率。
　　 本研究从450株海洋菌以及陆地样品中，分别筛选出了46株和99株产纤维素酶的菌株。通过鉴定发现，其中大部分归类于芽胞杆菌属、盐单胞菌属和假单胞菌属。从中克隆了8株芽胞杆菌属菌株的内切葡聚糖酶（EG）基因，进化树分析表明它们在核苷酸和蛋白质水平上分属不同的分支，具有一定的多样性。其中含有来自枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因cel5A的克隆在纤维素平板上显示出较高的水解圈活性。
　　 采用易错PCR和DNA shuffling的体外定向进化技术，本研究建立了来源于Bacillus subtilis BME-15的内切葡聚糖酶基因cel5A突变体库。利用刚果红染色法对突变体库中的71000株克隆进行筛选，得到了7株高活性突变株。其中内切葡聚糖酶突变体M44-11,S75和S78水解羧甲基纤维素钠的活性分别是野生型的2.03、2.54和2.68倍；此外，M44-11的酸碱耐受性和热稳定性也得到提高。通过同源模建，用Swiss-model构建了重组内切葡聚糖酶和各种突变酶的三维结构图。通过对酶分子结构的分析，发现M44-11,S75，S78的大部分突变位点氨基酸残基位于保守区域之外，只有S75的V255A突变位点处于活性中心，且毗邻于亲核基团Glu257附近。
　　 为了进一步研究突变位点在酶突变体中所起的作用，本研究通过环式PCR法分别构建了120位赖氨酸残基和272位天冬氨酸残基的突变酶。通过检测突变酶的水解圈活性发现，120位赖氨酸残基突变为谷氨酸和272位天冬氨酸残基突变为甘氨酸都可以部分提高酶的活性。这一现象表明，在突变酶S78和M44-11中可能存在多个突变位点的协同叠加作用而促进了酶的催化效率，而不是单个氨基酸残基突变产生的作用。同时这一结果也揭示了处于非活性中心或非结合位点的突变位点可能通过改变整个酶分子的空间位阻、催化残基之间的氢键网络形成来提高酶的催化特性。此外，对可能与底物相互作用的69位色氨酸残基和263丙氨酸-264丝氨酸-265甘氨酸残基的饱和突变结果表明，69位色氨酸残基的改变对酶活性的影响较小，而263丙氨酸-264丝氨酸-265甘氨酸残基的突变则会导致突变酶的活性严重丧失，这说明了该位点对底物结合起着非常关键的作用。
　　 本项研究为采用定向进化的方法改造第五家族糖基水解酶提供了有价值的理论参考。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表(Abbreviations)

声明

1前言

1.1纤维素资源概述

1.1.1纤维素原料

1.1.2纤维素结构

1.1.3纤维素的降解

1.2纤维素酶

1.2.1纤维素酶的来源

1.2.2纤维素酶的组成和结构

1.2.3纤维素酶的催化机制

1.2.4纤维素酶的克隆与表达

1.3蛋白质工程

1.3.1蛋白质工程的理性设计

1.3.2蛋白质工程的非理性设计——体外定向进化

1.4本研究目的和意义

2陆地、海洋微生物纤维素酶活性菌株的筛选及鉴定

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1菌株的筛选

2.2.2菌株的鉴定

2.3讨论

3芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆活性及进化树分析

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1芽胞内切葡聚糖酶基因的克隆

3.2.2不同克隆的水解圈活性检测

3.2.3内切葡聚糖酶基因的序列测定及进化树分析

3.3讨论

3.3.1芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因克隆与表达

3.3.2芽胞杆菌内切葡聚糖酶的进化树分析

4枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因的体外分子进化

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1易错PCR法构建突变体文库

4.2.2 DNA shuffling法构建突变体文库

4.2.3高活性突变子的筛选及序列分析

4.2.4突变体蛋白的表达与纯化

4.2.5酶活力的测定

4.2.6同源建模分析蛋白质构象

4.3讨论

4.3.1易错PCR构建突变体文库

4.3.2 DNA改组叠加有益突变

4.3.3突变体库的筛选

4.3.4突变酶的酶学性质

4.3.5突变酶的三维结构模拟

5枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因的定点诱变

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1野生酶和突变酶120、272位氨基酸定点突变

5.2.2野生酶69位和263-265位的饱和突变

5.3讨论

5.3.1定点突变的理性设计

5.3.2定点突变的策略

5.3.3 120和272位氨基酸残基功能分析

5.3.4 69和263-264-265位氨基酸残基功能分析

6总结

参考文献

致谢

附录：已发表的文章