水稻干旱胁迫蛋白质组相关数据和生物信息分析研究

摘要

干旱是影响很多重要作物产量和地理分布的主要非生物胁迫之一。水稻（Oryza sativa L．）不仅是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式种。利用组学方法研究水稻对干旱胁迫的应答机制，进而研究抗旱机理，对于全面揭示植物干旱适应的遗传基础，发掘干旱应答相关基因、蛋白和代谢物具有重要的意义。本文通过关联蛋白质组、转录组和代谢组的数据，运用生物信息学手段探讨了水稻在干旱胁迫下的整体反应、分析水稻抗旱的分子机制。
　　 四周大小的早稻品种IRAT109幼苗停止浇水3天之后，水稻叶片出现卷曲，相对电导率和脯氨酸含量升高，叶水势和土壤含水量下降。
　　 用双向电泳对水稻叶片全蛋白进行检测，发现1200多个可溶性蛋白，经T检验发现71个蛋白点丰度发生1.5倍以上显著变化（48个上调，23个下调）。将这些差异蛋白点进行MALDI-TOF-TOF-MS分析，有60个蛋白点得到有效的鉴定。大部分蛋白质是以前报道的与干旱等逆境胁迫相关，有4个是首次发现的与干旱应答有关的蛋白质，分别为腺苷高半胱氨酸水解酶（adenosylhomocysteinase）、醇酮酸还原异构酶（ketol-acid reductoisomerase）、蔗糖-LJDP葡糖基转移酶2（sucroce-UDP glucosyltransferase 2）、甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase）。对所鉴定的蛋白质通过Expasy、KEGG和NCBI数据库分析以及相关的文献查询对其功能进行了分类，发现这些蛋白质的功能涉及调节因子（regulatory factor）、过氧化物平衡（redox homeostasis）、代谢和能量（metabolism and energy）和细胞骨架（cytoskeleton）等六个方面，其中与调节因子类相关的蛋白最多，占总蛋白数的40％。
　　 通过cDNA芯片对水稻叶片mRNA的表达情况进行调查，总共发现4427个变化倍数在2倍以上的差异表达基因，其中有1812个上调基因、2615个下调基因。随机挑选40个差异基因设计引物进行荧光定量PCR（RT-PCR）验证，发现两者的相关系数为0.95。通过Gene Ontology（GO）分类系统对这些差异基因进行分类，发现这些基因主要分布在7个类别：细胞（cell）、细胞组分（cell part）、细胞器（organelle）、结合功能（binding）、催化功能（catalyitc）、亚细胞过程（cellular process）和代谢过程（metabolic process），整体上与差异蛋白的GO功能分类结果相吻合。相关性分析发现所有差异蛋白与其对应mRNA的表达水平的相关性系数只有0.08，同时各功能类蛋白的相关系数却不尽相同：调节因子类为-0.35、过氧化物类为0.03、能量与代谢类为0.02、抗旱相关类为0.82。
　　 利用气相色谱（GC）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用的方法，对水稻叶片的全代谢物进行调查。共发现129个代谢物，主成分分析（PCA）发现胁迫组和对照组可以明显分开。T检验发现有38个代谢物含量发生1.5倍以上显著变化，主要包括氨基酸、糖类和有机酸等。采用生物信息学方法对56个差异蛋白所参与的代谢通路（pathway）进行基于离散分布的显著性分析，总共发现13个代谢通路在干旱胁迫下受这些差异蛋白的调控，其中最显著代谢通路为光合作用中的碳固定（carbon fixation）过程。通过KEGG数据库对碳固定进行映射（mapping）分析，发现38个差异代谢物中的天冬氨酸（旱胁迫之后上调2.7倍）正好是最显著代谢途径碳固定中的一个组分。

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论文说明:缩略词表

声明

1前言

1.1 植物抗旱性研究进展

1.1.1 植物在干旱胁迫下的生理反应机制

1.1.2植物在干旱胁迫下的分子信号转导

1.1.3植物在干旱胁迫下的分子反应机制

1.2后基因组时代的植物组学研究

1.2.1 组学成分分析

1.2.2组学研究的生物信息学方法

1.2.3组学研究的进展

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1 试验材料

2.2试验方法

2.2.1干旱胁迫试验

2.2.1生理数据的测定

2.2.2蛋白质组实验

2.2.3转录组(cDNA芯片)实验

2.2.4代谢组实验

2.2.5生物信息分析

3结果与分析

3.1 蛋白质组结果分析

3.1.1双向电泳分析

3.1.2差异表达蛋白点的质谱鉴定

3.1.3差异蛋白的功能分析

3.2转录组结果以及与蛋白质组的相关分析

3.2.1转录组结果分析

3.2.2转录组和蛋白质组Gene Ontology功能分析

3.2.3蛋白组差异蛋白和对应mRNA的相关性分析

3.3代谢组结果和显著性代谢途径分析

3.3.1代谢组结果分析

3.3.2显著性代谢途径分析

4讨论

4.1 结论

4.2展望

参考文献

致谢

附表