斑点叉尾鮰疱疹病毒核酸探针检测方法的研究

摘要

本文对斑点叉尾鮰疱疹病毒核酸探针检测方法进行了研究。采用PCR方法制备地高辛标记DNA探针，分别建立了CCV PCR-ELISA检测方法和斑点杂交检测方法，主要结果如下：
　　 1．根据CCV的ORF6基因设计引物和捕获探针，其中捕获探针的5’端标记生物素，PCR产物在扩增过程中标记地高辛，利用经链亲和素包被的聚苯乙烯96孔酶标板固相杂交检测PCR产物，建立了CCV的PCR-ELISA检测方法。
　　 2．进行PCR反应条件的优化，结果表明：优化的PCR反应条件为25μL反应体系：1×PCR缓冲液、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L Mg2+、上下游引物各0.4 mmol/L、Tag DNA聚合酶1.0 U、模板1μL、用灭菌去离子水补足体积25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min、94℃30 s、58℃45 s、72℃30 s、35个循环；72℃延伸10 min，4℃保温。在最优的PCR反应条件下，将dNTP替换为DIG-dNTP，进行PCR产物标记反应，电泳结果表明成功将PCR产物标记上地高辛。
　　 3．建立PCR产物的固相杂交检测程序，并进行杂交条件的优化，结果表明最优的固相杂交检测参数为：最优探针包被浓度为50 pmol/mL；最优的杂交温度为42℃；最优的杂交时间为90 min。
　　 4．方法的特异性和敏感度检测实验表明：反应特异性强，与各对照均无交叉反应；反应敏感度为5fg CCV DNA。
　　 5．利用所建立的检测方法对人工感染样品进行检测，结果表明：所建立的方法能够用于人工感染样品的检测；利用常规琼脂糖凝胶电泳法对经检测判定为阳性的15份样品进行检测时，其中2份样品显示阴性，证明所建立方法敏感性更强。
　　 6．采用PCR方法制备地高辛标记DNA探针，建立了CCV斑点杂交检测方法。检测阈值为20 pg，特异性强。该检测技术可节省检测成本，为CCV的诊断提供更简单快捷的技术。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述

引言

1斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)研究进展

1.1 CCV特征和分类地位

1.2传染特性及病理学特征

1.3基因组和蛋白研究

1.4 CCV的检测技术

1.5 CCVD的防控技术

2微孔板杂交方法综述

2.1微孔板杂交方法原理和优点

2.2微孔板杂交方法分类

2.3微孔板杂交核酸固定方法

2.4微孔板杂交方法的应用

3研究目的与意义

4本研究的总体设计和技术路线

第二章 斑点叉尾鮰疱疹病毒PCR-ELISA检测方法的研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1目的片段的扩增和反应条件的优化

2.2热激转化结果

2.3质粒PCR鉴定

2.4序列测定

2.5固相杂交条件的优化

2.6阳性阈值(cutoff值)的确定

2.7模板DNA量与D405nm值的相关性

2.8特异性和敏感性检验

2.9人工感染样品的检测

3讨论

3.1 PCR-ELISA检测技术的优越性

3.2杂交程序的选择

3.3探针的固定

3.4杂交后信号显示方法的选择

3.5杂交温度的优化

3.6检测敏感性和特异性

3.7人工感染样品的检测

4小结

第三章 斑点叉尾鮰疱疹病毒斑点杂交检测方法的研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 DIG标记探针分析

2.2探针浓度优化

2.3斑点杂交检测敏感性分析

2.4斑点杂交检测特异性分析

3讨论

3.1斑点杂交用于样品检测的可行性

3.2探针标记方法的选择

3.3探针浓度的选择

3.4探针的特异性和敏感性

4小结

参考文献

致谢

附录