猪胚胎不同发育阶段MEST基因的分离、印记鉴定及启动子分析

摘要

表观遗传学(epigenetics)主要研究发育和细胞分化过程中,不涉及DNA序列改变而基因表达持久变异并稳定遗传的现象,是目前迅速发展的遗传学分支学科。表观遗传学主要包括三大研究领域:DNA甲基化、组蛋白乙酰化以及非编码RNA的调控作用。而基因组印记正是DNA甲基化修饰所造成的表观遗传效应的一个例子。基因印记是指来自双亲的等位基因差异表达,即只有父本(或母本)的等位基因表达而另一亲本的等位基因不表达或很少表达。在哺乳动物中,具有特定亲本特征的基因组印记在胎儿的生长发育、胎盘的功能及出生后的行为方面,都发挥着重要的调节作用。另外,有研究表明,印记基因常与一些先天性疾病、遗传疾病、某些癌症和肿瘤有关。然而目前,对基因组印记的研究主要集中在人和小鼠,在家畜特别是猪中研究的还比较少。所以本研究主要:(1)利用大白猪和梅山猪正反交模型,通过PCR产物直接测序法检测“表达的SNP”和RT-PCR-RFLP分析,鉴定了猪胚胎期不同发育阶段MEST基因的印记状态;(2)在大梅F2代群体及DIV系群体中,利用PCR-RFLP技术,进行了MEST基因的基因型与重要经济性状的关联分析,以期探讨印记基因在育种中作为分子标记的可行性;(3)克隆猪MEST基因启动子,检测启动子活性。主要结果如下:1.根据人和小鼠已知印记基因的印记状况及生理功能,选择MEST基因作为候选的印记基因。根据Genbank已发布的MEST基因序列(EF619473)设计引物,获得1248bp的片段;对所获得的猪MEST基因的cDNA序列,在3头大白猪和3头梅山猪间进行了序列比对,发现在133bp处存在一个G/A转换。2.利用生物信息学对MEST基因进行定位,并对其所编码的蛋白质结构及功能进行了预测和分析。3.利用大白猪和梅山猪正反交模型,通过RT-PCR-RFLP分析,鉴定了MEST基因在猪妊娠30天、65天和100天的印记状况。结果表明:(1)妊娠30天MEST基因表现为母系印记;(2)妊娠65天MEST基因在肾、胃、肌肉、脑和胎盘表现为母系印记,在心、肝、脾、肺、肠表现为双表达;(3)妊娠100天MEST基因在心、肝、肺、肾、胃、肌肉、脑和胎盘表现为母系印记,脾和肠表现为双表达。4.遗传效应分析:在7个国内外猪群体中统计基因型频率和基因频率,并在相关群体中进行了性状关联分析,结果表明:MEST基因G133A位点多态性与眼肌高、失水率、猪子宫重、猪产仔数呈显性相关,与眼肌宽呈极显性相关。5.采用半定量RT-PCR技术对MEST基因进行了不同组织间的表达量分析。结果表明:在梅大猪65天的各组织中,肌肉、肾、胎盘和脾表达量较高;在梅大猪100天的各组织中,肝、肾和心表达量较高,胎盘和肺表达量较低;在大梅猪65天的各组织中,胎盘和肾表达量较高,肝、脑和脾表达量次之;在大梅猪100天的各组织中,肌肉表达量较高,心和胎盘次之;在成年梅山猪各组织中进行的半定量RT-PCR分析表明,MEST基因在子宫中高表达,其次是肺。6.利用e!Ensembl预测MEST基因组全长,根据此序列设计引物扩增MEST基因的启动子,产物片段回收克隆测序;利用NNPP、MethPrimer、TFSEARCH等生物信息学软件对猪MEST基因的相关调控元件进行预测和分析。7.双荧光素酶报告基因系统检测重组子活性,结果表明:在所构建的猪MEST基因10个重组子中,除pDT-419和pDT-934外,其他重组子的荧光素酶活性与阴性对照均达到显著水平,表明它们均具有启动子活性;pDT-1134活性最强,证明其是核心启动子,与网站预测结构一致;pDT-1448到]pDT-1262、pDT-1134到pDT-934及pDT-587到pDT-419荧光素酶活性下降,说明这一区域可能存在正的调控位点;pDT-1601到pDT-1448、pDT-1262到pDT-1134、pDT-934到pDT-587及pDT-419到pDT-238荧光素酶活性升高,说明这一区域可能存在负的调控位点。

目录

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1 基因组印记的研究进展

1.1 基因组印记及其发现

1.2 印记基因的基本特征

1.3 基因组印记的可能分子机制

1.4 印记产生的几种假说

1.5 印记基因的验证方法

2 基因组印记的生物学意义

2.1 与胚胎发育

2.2 与疾病

2.3 与动物克隆

2.4 与家畜遗传育种

3 基因启动子的研究

3.1 启动子概念

3.2 启动子缺失分析

4 MEST基因的研究现状

5 研究的目的和意义

第二章 材料和方法

1 材料

1.1 血液及组织样品

1.2 载体和菌株

1.3 主要仪器与设备

1.4 常用试剂及其配制

1.5 主要试剂、试剂盒及培养基

1.6 常用的生物信息学网站或分析软件

2 方法

2.1 猪基因组DNA的提取

2.2 总RNA的提取及cDNA的制备

2.3 引物设计

2.4 PCR及PCR-RFLP分析(见表)

2.5 PCR产物的克隆检测

2.6 印记分析

2.7 关联分析

2.8 启动子功能分析

第三章 结果与分析

1 猪基因组DNA、总RNA的提取、cDNA的制备及检测

1.1 猪基因组DNA的提取

1.2 总RNA的提取

1.3 cDNA的制备及检测

2 猪MEST基因的分离、序列分析及基因染色体定位

2.1 猪MEST基因的克隆、测序

2.2 猪MEST基因的序列分析

2.3 猪MEST基因的染色体定位

3 猪MEST基因的印记鉴定及表达分析

3.1 猪MEST基因的印记鉴定

3.2 猪MEST基因的组织表达谱分析

3.3 猪MEST基因G133A位点与性状的关联分析

4 猪MEST基因启动子的克隆、生物信息学及功能的初步分析

4.1 猪MEST基因5’侧翼序列的获得

4.2 生物信息学预测MEST基因核心启动子及转录因子结合位点

4.3 猪MEST基因启动子区真核表达载体的构建

4.4 猪MEST基因启动子重组质粒的活性测定与分析

第四章 讨论

1 基因印记的分析方法

1.1 基于“表达的SNP”的分析方法

1.2 应用品种间正反交模型

2 MEST蛋白的生物信息学分析

3 候选印记基因的印记状态

4 候选印记基因的组织表达谱

5 MEST与营养冲突假说

6 印记基因在动物遗传育种中的应用

小结

参考文献

致谢