几种新型分子标记技术在中国香菇种质资源遗传多样性研究中的应用

摘要

香菇(Lentinula edodes)是产量仅次于双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的世界第二大人工栽培食用菌,在我国食用菌产业体系中占有举足轻重的地位。中国幅员辽阔,地理环境和气候条件十分复杂,孕育了丰富的香菇种质资源,这些种质资源是进一步选育香菇优良品种的基础。准确鉴定和客观评价是香菇种质资源保藏和利用的基础。相对于常用的形态标记和生化标记而言,基于DNA多态性的分子标记技术不受环境影响,且稳定、简便、精确,已成为食用菌遗传学各研究领域中的重要工具。各种分子标记技术的原理和技术体系各不相同,所揭示的遗传学信息也不相同,因此,各分子标记技术所反映的结果间可相互补充。目前,在食用菌遗传学研究领域,基于通用引物PCR的分子标记技术应用较多,而基于物种特异性DNA序列的分子标记技术,例如,基于微卫星两侧序列的SSR标记、基于特定编码基因序列的TRAP标记及基于反转录转座子的IRAP和REMAP标记,则应用极少。
　　 本研究首次在香菇中开发了SSR、TRAP、IRAP和REMAP四种新型分子标记的特异性引物、优化了相关标记的PCR技术体系,并将其应用于香菇野生菌株及栽培菌株的遗传多样性和亲缘关系分析。本研究的目的是:(1)评价4种新型分子标记技术的适应性,为进一步开展香菇遗传学研究提供新的方法；(2)从DNA水平深化对于中国香菇种质资源遗传多样性的认识,为合理地保护和利用这些资源提供科学依据。主要研究结果如下:
　　 1.采用数据库搜索法及ISSR-抑制PCR法开发香菇SSR标记,并选择6个野生菌株和2个栽培菌株来验证所开发引物的多态性。由数据库搜索法开发出21对引物,其中11对有多态性,各位点平均产生3.3个等位基因；通过ISSR-抑制PCR法开发出8对引物,其中5对具多态性,各位点平均产生3个等位基因。结果表明,两种方法在香菇SSR开发工作中均是行之有效的。
　　 2.使用正交试验设计及梯度PCR优化了香菇SSR技术体系,并利用该SSR技术体系分析了中国14个省份的55香菇野生菌株和1个栽培菌株的DNA多态性。25对引物共扩增出224条DNA片段,其中的223条具有多态性(99.6％)。供试菌株的相似性系数变化范围在0.692到0.987之间,平均值为0.803。SSR带型重复率、DNA平均相似性系数和Shannon多样性指数的差异表明,中国自然香菇种群具有丰富的遗传多样性,云南高原、横断山脉、台湾和华南地区菌株的遗传多样性尤为突出。UPGMA聚类分析及主坐标分析都将供试菌株分为3个大的类群,类群A主要由北方菌株组成,类群C由地处中国西南部的云南和广西菌株组成,其余菌株包含在类群B中,分析结果反映了我国南北菌株之间的差异,来自相同或相邻区域菌株具有优先聚为小类的趋势,表明菌株的分组与其地理来源关系明显。
　　 3.采用单因素循环筛选法优化了TRAP-PCR反应体系,并利用该TRAP技术体系分析了中国14个省份的55香菇野生菌株和1个栽培菌株的DNA多态性。12对引物组合共扩增出932条DNA片段,其中的929条具有多态性(99.68％)。供试菌株的相似性系数变化范围在0.503到0.947之间,平均值为0.696。Shannon多样性指数和平均遗传相似性系数表明,中国自然香菇种群具有丰富的遗传多样性,各种群间的遗传差异明显,云南高原、横断山脉、台湾、华南地区和东北地区菌株的遗传多样性比较明显。UPGMA聚类分析及主坐标分析都将供试菌株分为2个主要类群,类群B主要由云南菌株组成,其余菌株包含在类群A中,类群A可细分为7个亚群。分析结果很好地反映了供试菌株的地域分布规律,来自相同或相邻区域菌株具有优先聚为小类的趋势。
　　 4.比较SSR及TRAP分析的结果发现,高多态性的SSR和TRAP技术适于研究中国香菇野生种质。中国香菇自然种群具有丰富的遗传多样性,各种群间的遗传差异明显,分析结果较好地反映了供试菌株的地域分布规律。在8个种群中,云南高原和东北种群的独立性比较突出。对SSR与TRAP数据进行了整合分析,其结果与TRAP分析的结果非常相似(相关系数达到0.99),而与SSR分析的相关性较差(相关系数为0.68)。基于各种群间的平均相似性系数的UPGMA聚类结果也较好地反映了各种群间的地理来源关系。
　　 5.采用单因素循环筛选法和梯度PCR优化了香菇IRAP技术体系,并基于该体系开展了中国44个香菇栽培菌株的IRAP和REMAP遗传多样性分析。19对具多态性的引物组合共扩增出281条DNA片段,其中的273条具有多态性(99.6％)。供试菌株的遗传相似性系数变化范围在0.495到0.975之间,平均值为0.668。UPGMA聚类分析及主坐标分析结果都表明,供试菌株可根据栽培基质、温型及菌龄分为4个类群,类群A1主要包含中高温或广温型代料品种,类群A2全部为中短菌龄的中温或中低温型代料品种,而类群A3则为中长菌龄的中温或中低温型代料品种。类群B主要由段木品种组成。部分聚类关系较近的菌株表现出了某些共有的农艺性状特征。
　　 6.基于IRAP和REMAP分析结果,进行了SCAR标记的开发工作。在供试菌株9608中获得1条1712bp的特异性带,在菌株L135中扩增到1条2549bp的特异性带。通过切胶收回克隆并测序,BLAST搜索表明,仅源于9608的特异片段与豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)的反转座酶相关。应用软件Primer3设计SCAR标记引物对,成功地将它们转化为SCAR标记,用于对菌株9608和L135的特异性鉴定。本研究提供了一条新的SCAR标记开发技术手段,所建立的SCAR标记,为香菇栽培菌株的鉴定提供了准确可靠和迅捷方便的新途径。
　　 总体来看,4种新型分子标记技术均具有较高的多态性,适用于中国香菇种质资源的遗传多样性研究,所揭示的遗传信息与前人研究结果较一致。因此,本研究优化和建立的4种分子标记技术体系是实用、高效的,为进一步开展香菇特异性SCAR标记开发、杂交育种、遗传图谱构建和QTL定位等方面的研究工作提供了有力的研究手段。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第1章 文献综述

1.1 香菇研究概述

1.1.1 生物学特性

1.1.2 食药用功效

1.1.3 遗传育种进展

1.2 分子标记技术的类型及其在食用菌研究中的应用

1.2.1 分子标记的类型

1.2.2 分子标记技术在食用菌研究中的应用

1.3 本研究的目的和意义

第2章 香菇SSR标记的开发及SSR-PCR技术体系的优化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验试剂

2.2.3 试验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 ISSR-抑制PCR法开发SSR标记

2.3.2 数据库搜索法开发SSR标记

2.3.3 SSR引物的筛选

2.3.4 SSR-PCR反应体系的建立和优化

2.4 讨论

2.4.1 ISSR-抑制PCR法开发香菇SSR标记

2.4.2 数据库搜索法开发香菇SSR标记

2.4.3 SSR-PCR反应体系的建立和优化

第3章 中国香菇野生种质遗传多样性的SSR分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 供试菌株

3.2.2 试验试剂

3.2.3 试验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 SSR标记的多态性

3.3.2 基于SSR标记的聚类分析

3.3.3 基于SSR标记的主坐标分析

3.4 讨论

第4章 中国香菇野生种质遗传多样性的TRAP分析

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 供试菌株

4.2.2 DNA提取

4.2.3 TRAP引物设计

4.2.4 PCR反应体系优化

4.2.5 TRAP-PCR扩增

4.2.6 数据分析

4.2.7 扩增条带的序列测定

4.3 结果和分析

4.3.1 TRAP-PCR体系的优化

4.3.2 TRAP标记的多态性

4.3.3 基于TRAP标记的遗传相似性分析

4.3.4 基于TRAP标记的聚类分析

4.3.5 基于TRAP标记的主坐标分析

4.3.6 TRAP标记真实性的验证

4.4 讨论

4.4.1 TRAP-PCR的优化

4.4.2 TRAP标记技术

4.4.3 中国香菇野生种质的遗传多样性

第5章 中国香菇野生种质遗传多样性的SSR和TRAP整合比较分析

5.1 前言

5.2 中国香菇野生种质遗传多样性SSR及TRAP分析间的比较

5.2.1 两种标记方法间的相似点

5.2.2 两种标记方法间的不同点

5.3 中国香菇野生种质遗传多样性的SSR和TRAP数据整合分析

5.3.1 遗传相似性分析

5.3.2 聚类分析

5.3.3 主坐标分析

5.3.4 讨论

第6章 中国香菇栽培种质遗传多样性的IRAP和REMAP分析

6.1 前言

6.2 材料和方法

6.2.1 供试菌株

6.2.2 DNA提取

6.2.3 引物设计

6.2.4 PCR反应体系优化

6.2.5 IRAP-PCR扩增

6.2.6 数据分析

6.3 结果和分析

6.3.1 IRAP-PCR体系的优化

6.3.2 IRAP和REMAP标记的多态性

6.3.3 基于IRAP和REMAP标记的遗传相似性分析

6.3.4 基于IRAP和REMAP标记的聚类分析

6.3.5 基于RAP和REMAP标记的主坐标分析

6.4 讨论

6.4.1 IRAP-PCR的优化

6.4.2 IRAP及REMAP标记技术

6.4.3 香菇栽培菌株的遗传关系

第7章 香菇栽培菌株IRAP-SCAR标记的开发

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 供试菌株

7.2.2 特异性扩增条带的序列测定

7.2.3 引物设计

7.2.4 PCR扩增

7.3 结果和分析

7.3.1 特异性带选择

7.3.2 DNA回收

7.3.3 菌落PCR检测

7.3.4 测序结果

7.3.5 SCAR引物设计

7.3.6 SCAR-PCR

7.4 讨论

全文结论

本论文主要创新点及下一步研究工作设想

参考文献

致谢

附录1 测定的12个TRAP序列

附录2 16个野生香菇菌株的IRAP聚类结果

附录3 攻读博士学位期间发表与课题相关的论文