铜绿假单胞菌FabI抑制剂的筛选及微生物降解2-MIB的研究

摘要

本论文包括两方面内容：铜绿假单胞菌烯酰-ACP还原酶抑制剂先导化合物筛选和一株高效降解2-甲基异茨醇微生物的筛选鉴定及其BAC文库的构建。
　　本研究通过计算机辅助的虚拟药物筛选方法，从中药化合物库中分离出五种可能具有烯酰-ACP还原酶（FabI）抑制能力的中药单体作为先导化合物。分别是：姜黄素（Curcumin）、木犀草素（Luteolin）、欧前胡素（Imperatorin）、染料木素（Genistein）和白藜芦醇苷（Polydatin）。
　　克隆表达了铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC15442 FabI（PaFabI），并成功构建的由FabI催化的体外反应体系。通过该体系检测了五种先导化合物对大肠杆菌Escherichia coli FabI（EcFabI）和PaFabI的抑制能力。它们对EcFabI的抑制能力由大到小依次为：木犀草素、欧前胡素、白藜芦醇苷、姜黄素和染料木素。对PaFabI的抑制能力依次为：三氯生、木犀草素、白藜芦醇苷、染料木素和姜黄素，而欧前胡素对PaFabI催化的还原反应起到了明显的促进作用。
　　抗菌实验结果表明，姜黄素对野生型E.coli MG1655的生长具有显著的抑制效果，MIC90为0.2μmol/L；而对过量表达EcFabI的E. coli CY1655则没有表现出抗菌活性；此外姜黄素对P.aeruginosa ATCC15442也有微弱的抑制能力，MIC90为5μmol/L。木犀草素对P.aeruginosa ATCC15442有一定的抗菌能力，MIC90为1.0μmol/L。
　　综合菌体水平和酶体水平的实验结果，对木犀草素和姜黄素对EcFabI的抑制，木犀草素和白藜芦醇苷对PaFabI的抑制做进一步分析。结果表明：木犀草素通过反竞争抑制模型对EcFabI和PaFabI进行抑制，其Ki值分别为7.05nmol/L和0.40nmol/L；姜黄素通过和木犀草素相同的方式抑制EcFabI的活性，其Ki值为14.96nmol/L；白藜芦醇苷通过竞争性抑制机制对PaFabI产生抑制效果，其Ki值为0.40nmol/L。
　　2-甲基异茨醇（2-MIB）是一种放线菌和蓝细菌等微生物的次生代谢产物，2-MIB的过量累积引起了养殖水体及饮用水的异味问题，已经成为目前水污染研究的热点。目前，常规水处理工艺无法有效的去除污染水体中微量2-MIB，生物治理则能够避免常规物理化学等处理方法的弊端，成为2-MIB水体污染治理的最新研究方向。
　　本研究通过格氏反应以d-樟脑为底物合成了纯度达到98%的2-MIB。并从湖北省武汉市各地采集的污水水样中成功分离出一株能够高效降解2-MIB的微生物菌株，降解率最高可达89.7%。16SrDNA鉴定结果显示，该菌株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。此外，还通过基因工程手段成功构建了该高效降解菌的BAC文库，共获得810个转化子，外源片段平均大小为40kb，文库覆盖率为8倍。BAC文库的构建为今后研究该菌降解2-MIB的分子机制打下良好平台。

目录

声明

缩略语表

第一章 铜绿假单胞菌烯酰-ACP还原酶抑制剂先导化合物筛选

1.1前言

1.1.1假单胞菌属病原菌及其危害

1.1.2铜绿假单胞菌耐药机理及研究现状

1.1.3 新型抗生素的筛选策略

1.1.4 以烯酰-ACP还原酶为靶标的抗生素筛选

1.1.5 研究目的及意义

1.2实验材料

1.2.1 菌株、质粒和引物

1.2.2 培养基

1.2.3 试剂

1.2.4 仪器

1.3实验方法

1.3.1 fabI 基因的克隆与表达

1.3.2 蛋白的表达与纯化

1.3.3 FabI体外活性检测方法的建立

1.3.4 FabI新型抑制剂先导化合物的计算机虚拟筛选

1.3.5 先导化合物抗菌活性测定

1.3.6 先导化合物抑制活性检测及抑制模型的预测

1.4结果分析与讨论

1.4.1 fabI基因PCR扩增

1.4.2 蛋白的表达及纯化

1.4.3以holo-ACP为底物检测FabI酶活

1.4.4抑制剂先导化合物计算机虚拟筛选结果

1.4.5 先导化合物MIC90值测定

1.4.6 先导化合物抑制活性检测结果

1.4.7 抑制剂先导化合物抑制模型的确定

1.5小结

第二章 一株高效降解2-甲基异茨醇微生物的筛选鉴定及其BAC文库的构建

2.1 前言

2.1.1 2-甲基异茨醇（2-MIB）的产生及危害

2.1.2 2-MIB研究概况

2.1.3 2-MIB的常规水处理工艺

2.1.4 生物降解2-MIB

2.1.5研究目的及意义

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器

2.2.3实验方法

2.3 结果分析与讨论

2.3.1 2-MIB的有机合成及检测

2.3.2 降解菌株的分离鉴定

2.3.3 降解菌株生长曲线的测定

2.3.4 BAC文库构建及检测

2.4 小结

参考文献

致谢

附录

附录1 P.aeruginosa ATCC15442 fabI基因测序结果

附录2 Z5 16SrDNA测序结果