猪链球菌的耐药性及猪链球菌在健康猪群中分布特征的研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis, S.suis)是猪群上呼吸道一种常在的革兰氏阳性球菌,主要存在于扁桃体和鼻腔内。猪群感染猪链球菌后的临床症状一般有脑膜炎,败血症,关节炎和肺炎等。猪链球菌感染一直是困扰全球养猪业的主要问题。本研究对我国猪链球菌的耐药性及对喹诺酮耐药特征,以及健康猪鼻腔中猪链球菌分布特征进行研究,为猪链球菌病的基础研究及预防、控制与诊断奠定一定的基础。研究的主要内容如下:1.猪链球菌耐药性研究用链球菌药物敏感性检测板对本室临床发病猪分离的126株与健康猪鼻腔分离的23株猪链球菌进行药物敏感性试验。结果显示149株分离菌株对美罗培南和万古霉素均100％敏感;对β-内酰胺类、喹诺酮类等药物一般较为敏感;对四环素、大环内酯类、林克胺类等药物的耐药性普遍较强。其中109株(73.2%)菌表现出至少对4种药物不敏感。通过对耐药性进行比较,发现健康猪鼻腔分离的S.suis对β-内酰胺类、大环内酯类、氯霉素类、喹诺酮类以及磺胺类药物的耐药性明显高于临床发病猪分离的S.suis。经统计学分析,猪链球菌血清2型与其耐药性之间有一定的相关性(P<0.01),而其它试验菌株的耐药性与其血清型之间无明显相关性(p>0.05)。该试验结果为猪链球菌病的治疗提供了用药依据。2.猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药特征的研究对国内分离的149株猪链球菌进行药物敏感性检测,从中筛选出来的11株对喹诺酮药物耐药和2株中介菌株都是多耐菌株,至少耐受5种药物,且除1株菌的毒力基因型是sly+/mrp*+外,其它12株菌的三种毒力基因都没有扩增出来。说明S.suis对喹诺酮的耐药性有可能影响S.suis对其他抗生素也产生耐药性以及其本身的毒力因子的缺失,这有待于进一步研究。通过对喹诺酮耐药基因序列进行分析,发现耐药菌株的parC、parE、gyrA和gyrB基因编码的氨基酸均发生了点突变,而且还发现了一些未曾报道的新的突变位点。本研究结果表明,ParE的Ala552-Thr的突变结合GyrB上的Ala427-Thr突变,可能是一种导致S.suis对加替沙星敏感性降低的一级突变。发现在ParC QRDR的Ser79-Tyr的氨基酸突变有可能导致S.sui对加替沙星产生耐药性,证实了喹诺酮类药物对S.suis作用的第一靶位点是parC基因。同时证实了随着突变位点的增多, S.sui对氟喹诺酮的敏感性在逐渐降低。并且在ParC和GyrA QRDR上的氨基酸突变是S.suis对氟喹诺酮类药物产生耐药性的关键因素。通过分析进化关系,发现S.suis对氟喹诺酮产生耐药性是由于在药物选择压力下自身耐药基因发生突变造成的,而不是由于同种细菌种内传播或其它细菌基因水平转移造成的。同时用外排泵抑制剂也证实了S.suis的多药耐药现象以及对喹诺酮的耐药性与外排泵有很大的关系,是相关耐药基因的突变和外排泵等多种耐药机制共同作用的结果。3.猪链球菌在健康猪群中分布特征的研究本次试验,从山东,湖南,湖北,江西四个省份的健康猪场中采集鼻腔拭子样品共分离240株S.suis,其中只有一株SS2菌株。血清分型结果显示,健康猪鼻腔中的S.suis,优势血清型依次是全凝菌株61株、多凝菌株42株和21/29型菌株33株。优势致病血清型依次是猪链球菌16型7株、4型3株和8型2株。而且发现有些鼻腔拭子可以分离出2-4种血清型。用ERIC-PCR技术分析S.suis菌群结构,结果表明健康猪鼻腔分离的S.suis其基因指纹图谱呈多态性分布,有76%的分离菌株带谱相似性在50%-100%之间,可分成29簇,24%的分离菌株不能成簇。同一地区分离的大部分菌株的带谱相似性在70%以上。MLST分型结果显示,菌株SDJA6属于ST7型,XJ12属于ST14,分析的其它14株菌不能分型,属于新的STs,已向S.suis MLST数据库申请新的ST号,表明健康猪鼻腔分离的S.suis呈多克隆系并存的状态。同时发现有些不同遗传背景和不同血清型的菌株属于同一菌株的克隆,而有些相同血清型的菌株,其ST却迥然不同,说明S.suis的血清型不能用来判断菌株之间的遗传关系,结合血清学分型和指纹图谱分析都提示了S.suis的荚膜多糖基因可能会在猪链球菌菌群中发生水平转移。

目录

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摘要

Abstract

缩略词(Abbreviation)

第1章 文献综述

前言

1.1 病原学研究进展

1.1.1 病原特性的研究

1.1.2 病原血清分型与致病性的研究

1.2 流行病学研究进展

1.2.1 流行特征

1.2.2 传播途径及易感动物

1.3 毒力相关因子的研究进展

1.4 检测与鉴定方法的研究进展

1.4.1 微生物学检测与鉴定方法

1.4.2 免疫学检测与鉴定方法

1.4.3 分子生物学检测与鉴定方法

1.5 猪链球菌耐药性研究进展

1.6 猪链球菌对喹诺酮类药物的耐药性及耐药机制的研究进展

1.7 总结与展望

第2章 猪链球菌耐药性研究

前言

2.1 实验材料

2.1.1 试验及质控菌株

2.1.2 主要药品与试剂

2.1.3 主要培养基与主要溶液的配制

2.1.4 主要实验器材

2.2 实验方法

2.2.1 质控菌株与猪链球菌的复壮

2.2.2 接种物的制备

2.2.3 药敏板接种与孵育

2.2.4 记录药敏板读数

2.2.5 结果判断和处理

2.3 结果与分析

2.3.1 我国猪链球菌的耐药性

2.3.2 临床发病猪与健康猪鼻腔分离的猪链球菌耐药性的比较

2.3.3 耐药性与血清型的关系

2.4 讨论

2.4.1 猪链球菌的耐药性

2.4.2 临床发病猪与健康猪分离的猪链球菌耐药性的比较

2.4.3 耐药性与血清型的关系

第3章 猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药特征的研究

前言

3.1 实验材料

3.1.1 菌株

3.1.2 主要试剂药品及质粒

3.1.3 主要培养基

3.1.4 主要仪器

3.2 试验方法

3.2.1 试验分析菌株的筛选

3.2.2 试验分析菌株全基因组的提取

3.2.3 试验菌株毒力因子基因的扩增

3.2.4 喹诺酮类药物耐药基因的扩增

3.2.5 喹诺酮类药物耐药基因PCR产物的回收

3.2.6 喹诺酮类药物耐药基因PCR产物的克隆与测序

3.2.7 喹诺酮耐药基因序列及其进化关系的分析

3.2.8 外排泵抑制剂对猪链球菌耐药性的影响

3.3 结果与分析

3.3.1 试验分析菌株的筛选

3.3.2 试验菌株毒力因子基因的扩增

3.3.3 喹诺酮类药物耐药基因的扩增

3.3.4 喹诺酮耐药基因的测序结果与分析

3.3.5 喹诺酮类药物耐药基因的同源性分析

3.3.6 外排泵抑制剂对猪链球菌耐药性的影响

3.4 讨论

3.4.1 猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性

3.4.2 氟喹诺酮的耐药性对猪链球菌的药物敏感性及其毒力的影响

3.4.3 猪链球菌对喹诺酮耐药基因的相关性分析

3.4.4 外排泵抑制剂对猪链球菌耐药性的影响

第4章 猪链球菌在健康猪群中分布特征的研究

前言

4.1 实验材料

4.1.1 菌株

4.1.2 主要试剂与药品

4.1.3 主要培养基及其配置

4.1.4 主要实验仪器

4.2 试验方法

4.2.1 细菌的分离鉴定

4.2.2 血清学分型鉴定

4.2.3 细菌基因组DNA的提取

4.2.4 ERIC-PCR法扩增猪链球菌的DNA指纹图谱

4.2.5 MLST基因分型

4.3 结果

4.3.1 细菌的分离鉴定

4.3.2 血清学分型鉴定

4.3.3 猪链球菌的DNA指纹图谱

4.3.4 MLST基因分型

4.4 讨论

4.4.1 细菌的分离鉴定

4.4.2 血清学分型鉴定

4.4.3 猪链球菌的DNA指纹图谱

4.4.4 MLST基因分型

第5章 结论

参考文献

致谢

附录